[생명과학/실험] Plasmid DNA preparation

 

Date 

 

2011. 5. 24

 

 

 

Subject

 

to learn the alkaline lysis method to isolating plasmid and the principle of the method

 

 

 

Abstract

 

Most of bacteria and some eukaryotic cells have plasmid, an extra-chromosomal DNA which is circular. It is typically small than normal chromosomes and double-stranded DNA molecule. Bacteria can accept plasmids mear them and use it. In addition, we can insert certain genes to plasmids by using restriction enzymes and ligase. Because of  these features, the plasmid can be used as vector which contains certain genes and insert it to bacteria.

 

If we use the plasmid as a vector (se also call the vector plasmid as "recombinant plasmid"), some conditions are required. First, the plasmid need a replication origin. To dulpicate the DNA, a primer must recognize the replication origin and be attached to it. Second, an antibiotics resistance gene is required. We use the antibiotics to select recombinant plasmids. If bacteria bave the plasmid, they do not die in the medium containing certain antibiotics, In the contrast, if the bacteria do not have the plasmid, they die in the medium. The final condition is having multiple cloning site(MCS). THere are many restriction enzyme site, so we can insert the gene in MCS using proper restriction enzymes.

 

 There are some methods to preparate plasmid from bacteria - alkaline lysis method, CsCl-EtBr gradient equilibrium centrifugation, anion-exchange chromatography method, and polyethylene glycel method. Alkaline lysis method is commonly used, and it uses complex compounds, acid and base to break cell wall and memgrane and get the plasmids. First, break the cell wall on maintainging the shape of cell. Next, break the cell membrane and denaturate chromosomal DNA. Third, make the chromosonal DNA coagulated and separate the solution containing plasmids by centrifuging. Finally, purify the plasmids, then you will get the pure plasmids.

 

 

 

Materials

 

Solution 1

Solution 2

Solution 3

Incubated E.coli

DNA spin column

Elution Buffer

Wash Buffer (PW)

pipette

tip

1.5ml tube

cengrifuge

 

 

 

Procedure

 

<Preparation of clared lysate>

 

1. Cescend the bacterial cells by centrifuging for 2 min and discard the supernant completely.

 

2. Add 250㎕ of Sol 1, and re-suspend the cells by pipetting.

 

3. Add 250㎕ of Sol 2, and gently invert the tube 10 times to lysis the cells and incubate them at RT for 2 min.

 

4. Add 350㎕ of Sol 3, and invert the tube 10 times immediately but gently.

 

5. Centrifuge for 10 min, 10,000rpm.

 

<Isolation and purification of plasmid DNA>

 

6. Transfer the supernatant carefully to column set. Then wait for 5 min.

 

7. Centrifuge for 1 min then discard the flow-through. (Do not transfer any white pellet.)

 

8. Add 700㎕ of Wash Buffer PW

Results

Discussion 

1. What is the key difference used to separate between chromosomal DNA and plasmid DNA?

  plasmid DNA를 분리하기 위한 직접적인 단계는 sol 2와 sol 3를 넣는 단계이다. plasmid는 cell 안에서 supercoiled form으로 존재하기 때문에 쉽게 denaturation되지 않는다. sol 2는 NaOH를 포함한 강염기 용액으로 SDS가 cell membrane을 깨면 흘러나온 cytosol과 만나 그 안의 chromosomal DNA를 denaturation시킨다. chromosomal DNA는 단순히 풀린 형태로, supercoiled form인 plasmid보다 쉽게 변형된다. sol 3이 pH를 정상 상태로 급격히 돌려놓을 때, plasmid DNA는 renaturation되나 chromosomal DNA는 엉기게 되어 하얀 응어리로 남게 되는 것이다. 결과적으로, 우리는 sol 3까지 처리한 tube를 centrifuging시킨 후 상층액에서 plasmid를 분리해낼 수 있다.

  한편, chromosomal DNA를 분리하기 위한 과정은 plasmid DNA prep 과정과 cell wall과 cell membrane을 깨는 것에서는 동일하나, 그 이후 과정에서 차이가 있다. RNase와 protease를 이용해 cytosol 속의 RNA와 protein들을 제거한 뒤 centrifuging을 하면 상층액에 DNA가 존재하고 나머지는 pellet으로 가라앉게 된다. 이 상층액을 분리하여 ethanol 처리를 하면 DNA는 ethanol과 결합하여 침전하게 된다. 이를 다시 centrifuging하여 건조하면 pure DNA를 얻을 수 있다.

2. Discuss the role of the solution 1, 2, 3 and their components of the materials used during plasmid DNA prep.

  1. Solution 1(EDTA, glucose4, Tris-Cl) : 

EDTA는 complex compound의 일종으로, cell wall을 유지하는 데에 필수적인 calcium ion과 결합해 cell wall을 부분적으로 파괴한다. glucose는 cell 내외의 osmosis를 유지시켜 cell wall이 깨져도 그 모양은 흐트러지지 않도록 도와준다. Tris-Cl은 약한 base로 역시 denaturation을 통해 cell wall의 파괴를 돕는다.

  2. Solution 2(SDS, NaOH) : 

SDS(sodium dodecyl sulfate)는 ionic detergent로, cell membrane의 lipid를 용해하여 cell membrane을 파괴한다. NaOH는 강한 base로, cell membrane이 파괴된 후 흘러나온 cytosol에 포함된 DNA를 denaturation시킨다. 이 때, chromosomal DNA는 단순히 풀어진 double-stranded DNA로 존재하여 쉽게 denaturation되는 반면, 작고 supercoiled form으로 꼬인 채 존재하는 plasmid DNA는 쉽게 denaturation되지 않는다.

  3. Solution 3(potassium acetate) : 

약산성인 potassium acetate가 첨가되면 세포 내 pH는 급격히 정상수치로 돌아오게 된다. 이 때 거의 denaturation되지 않은 plasmid는 곧바로 renaturation되지만, chromosomal DNA는 도리어 potassium과 결합해 엉기게 된다. 이를 centrifuging시키면 denaturated DNA는 white pellet으로 바닥에 남고, 상층부에는 plasmid DNA가 남게 된다.

 

References

 

http://wiki.answers.com/Q/How_is_plasmid_DNA_different_from_chromosomal_DNA

http://biochemistry.yonsei.ac.kr/biochem_molecular/gene_cloning_20.php

http://biochemistry.yonsei.ac.kr/biochem_molecular/gene_cloning_18.php

http://www.cyworld.com/junepr/2632836

http://blog.naver.com/PostView.nhn?blogId=ryu091011&logNo=110108170990

 

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