Western blotting

 

1975년 미국의 서던(E.M. Southern)은 한천으로 만든 판에 전기영동한 DNA를 nitrocellulose 막에 옮긴 뒤, 그 막에 방사성 동위 원소 표지를 한 DNA 또는 RNA를 혼성화(hybridization)시켜 원하는 DNA의 막 상의 위치를 검출해내는 방법을 개발하였다. 이는 그의 이름을 따서 Southern blotting이라고 불린다. 이후, 이를 응용하여 다른 생체 고분자들을 검출하는 방법도 개발 되었는데, RNA를 검출하는 방법은 Northern blotting, 단백질을 검출하는 방법은 Western blotting이라 명명되었다.

 

세 가지 분석 방법은 각각 DNA, RNA, 단백질을 타겟으로 하나, 전기영동을 사용하여 분리한 분자들을 얇은 막에 옮겨 '탐침(probe)'을 이용하여 원하는 분자를 찾아내는 점에서 공통점을 가진다. 여기서 탐침은 목적으로 하는 분자와 상보적으로 결합하며 우리가 그 결과를 검출해낼 수 있게 하는 분자이다. Southern blotting의 경우 탐침은 RNA 혹은 DNA인데, 이는 목적으로 하는 DNA와 상보적으로 결합하여 우선 분자를 찾아내는 능력을 가지고, 다음으로 방사성을 띠어 그 위치 또한 정확하게 알아낼 수 있도록 한다. RNA를 찾아내는 Northern blotting의 탐침 역시 DNA 혹은 RNA이다. 하지만 목표 분자가 단백질인 Western blotting의 경우, 탐침은 항체(antibody)가 된다.

 

Western blotting의 과정을 간단히 요약하자면 다음과 같다.

(1) SDS-PAGE

(2) Nitrocellulose 막에 단백질 이동

(3) 항체 처리

(4) 항체 검출을 통한 목적 단백질 검출

 

Western blotting을 위해 가장 먼저 해야 할 일은 시료 준비이다. 보통은 세포 내의 단백질 혼합물들 속에서 원하는 단백질을 찾아내므로 cell lysis를 통해 세포를 깬 후 여러 번의 원심 분리와 washing을 통해 단백질이 든 층만을 분리해서 이용한다. 만약 조직으로부터 단백질을 얻고자 할 경우에는 sonication 등을 이용해 조직을 잘게 부수는 과정이 선행되어야 한다.

 

시료가 준비되었다면, 이제는 시료 중의 수많은 단백질들을 하나하나씩 전개할 차례이다. 단지 튜브 안에 극소량으로 들어있는 상태로는 탐지가 어려울뿐만 아니라 있는지 없는지에 대한 대략적인 정보만을 얻을 수 있기 때문에, 단백질을 넓게 펼쳐줄 필요가 있다. 이 때 가장 흔히 사용되는 것이 polyacrylamide gel(PAG)과 sodium dodecyl sulfite(SDS)이다. SDS는 단백질의 disulfate bond를 끊어 단백질을 선형으로 만들고 모든 단백질의 전하를 (-)로 만들어 단백질이 gel 상에서 (+)극을 향해 끌려가도록 한다. PAG은 DNA와 RNA의 전기영동에 이용되는 agarose gel과 같이 일정한 격자 모양을 가지고 있어서 선형으로 된 단백질을 전기영동을 통해 크기별로 분리하는 데에 적합하다.

 

 

SDS로 denaturation된 단백질들을 PAG 상에 전기영동(electrophoresis) 시켜 전개하는 것이 바로 SDS-PAGE이다. 이 과정은 위의 그림에서 볼 수 있듯이 (-)에서 (+)로의 이동이 위에서 아래로 진행되므로 gel 역시 세워져야 한다. 때문에 gel은 일종의 틀인cassette에 gel을 만드는 재료를 채워넣은 후 굳혀 만든다. SDS는 이 gel을 만들 때 포함된다. Gel의 가장 위층에는 굳기 전에 comb을 꽂아 놓아 protein을 흘려넣을 수 있는 여러 개의 구멍, 즉 well을 만들어 놓아야 한다. 단백질은 투명하므로 loading dye를 이용해 단백질이 전개되는 양상을 눈으로 확인할 수 있도록 한다. 각 well에 원하는 단백질 시료를 loading하고 전압을 걸어주면 단백질이 gel상에서 3차, 4차 구조를 잃고 선형이 된 채 크기에 따라 분류되면서 전기영동된다. 이 결과, 각 well에서부터 전개된 단백질들은 loading dye의 색을 띤 가로로 긴 밴드 여러 개로 보이게 된다. 이 때 너무 오래 전기영동을 시키면 가벼운 단백질이 먼저 gel을 빠져나갈 수 있기 때문에 적당히 전개되도록 주의해야 한다.

 

2차원적으로 펼쳐진 단백질들은 분자 크기별로 나뉘어져 있기 때문에 하나의 밴드는 한 종류의 단백질을 의미한다고 볼 수 있다. 하지만 이 단백질들은 gel 속에 묻혀있기 때문에 탐침과 단백질의 직접적인 결합을 보는 것이 힘들다. 그래서 단백질을 얇은 막 위로 옮겨서 탐침과 쉽게 결합할 수 있도록 하는 작업, 즉 transferring이 필요하다. 여기에는 nitrocellulose 혹은 polyvinylidene difluoride(PVDF)가 막으로 이용된다. Transferring에도 많은 종류가 있다. Buffer를 흡수하여 buffer의 이동에 따라 단백질이 함께 이동해 막에 붙게 하는, 초기에 많이 이용되었던 방법인 diffusion transfer뿐만 아니라  capillary transfer, heat-accelerated convectional transfer, vacuum blotting transfer 등 아주 많은 transfer 방법이 존재한다. 그 중 가장 널리 쓰이는 것은 전기를 이용하는 electroelution, 혹은 electrophoretic transfer이다. 이름에서 볼 수 있듯 이는 전기영동과 매우 비슷한 원리를 이용한다(밑에서 설명). 여기에도 두 가지 종류가 있는데, 하나는 수평으로 gel을 위치시켜 분리하는 semi-dry transfer이고, 다른 하나는 수직으로 gel을 세워 buffer를 채운 상태에서 분리하는 wet transfer이다. 또한, 단백질이 hydrophillic일 때는 nitrocellulose를 주로 이용하나, 단백질이 hydrophobic일 때는 PVDF를 이용한다. PVDF는 단백질과 소수성 상호작용을 통해 결합하며,  너무 오래 loading하면 단백질이 막을 통과해버릴 수 있으므로 주의해야 한다.

 

Wet transfer를 잠시 살펴보면, 먼저 전기영동이 끝난 gel을 조심스럽게 분리해내어 transfer membrane과 겹친다. 그리고 양쪽으로 filter paper와 pad를 두어 buffer를 충분히 빨아들이게 하고 gel을 보호하게 하며, 그 양쪽으로 음극과 양극을 위치시킨다. 이 때 단백질은 (+)쪽으로 끌려가므로 membrane은 (+)쪽에 위치시켜야 한다. 전압이 걸리면 단백질들은 gel에서 막으로 천천히 이동하고, 막 위에 붙게 된다.

 

 

막 위로 단백질이 옮겨지면 또다른 단백질들이 더 이상 막에 붙지 않게 하기 위한 blocking 작업이 요구된다. 이는 또다른 단백질을 대량으로 막에 처리하는 작업이라 할 수 있다. 즉, 시료 단백질들이 붙은 자리를 제외한 모든 구역에 우리가 이미 알고 있는, 그러나 탐침과는 반응하지 않는 단백질을 붙여버리는 것이다. 이 작업을 하면 더이상 다른 단백질에 막이 오염되지 않을 수 있고, 항체 역시 막에 무분별하게 붙지 않게 하고(항체도 기본적으로 단백질이므로 막에 잘 붙는다) 정확히 목표로 하는 단백질에 붙게 할 수 있다. Blocking에 이용되는 단백질은 3-5% Bovine serum albumin (BSA) 혹은 non-fat dry milk로, 둘 다 생체 내에 아주 풍부하며 가격이 싸고 다루기가 쉬워 실험 전반적으로 많이 이용되는 단백질들이다.

 

Blocking 작업까지 완료된 후에야 드디어 항체를 이용한 detection을 할 수 있다. 탐침인 항체는 단일 클론 림프구들에게서 만들어지며, 목표로 하는 단백질에만 특이적으로 결합하는 성질을 가진다. 즉, 실험을 위해 미리 준비되어야 하는 물질이며, 타겟 단백질에 따라 서로 다른 종류의 탐침을 만들어 사용해야 한다. 탐침으로 이용되는 항체는 형광 물질로 표지되어 있거나 방사성 동위원소를 가지며, 1차 항체 혹은 2차 항체가 이용될 수 있다. 흔히 이용되는 것은 horseradish peroxidase와 luminol을 이용한 2차 항체이다. 목표로 하는 단백질에 붙는 1차 항체에 대한 2차 항체에 HRP를 붙인 후 여기에 luminol을 처리하면 peroxidase인 HRP가 luminol을 산화시켜 형광을 내뿜게 한다. 이 빛을 필름에 감광시켜 인화하면 membrane 상의 단백질의 위치를 최종적으로 알아낼 수 있으며, 함께 loading한 protein marker와 밴드의 굵기를 통해 단백질의 대략적인 크기와 양도 알아낼 수 있다.

 

 

 

http://en.wikipedia.org/wiki/Western_blot

http://www.bio.davidson.edu/courses/genomics/method/westernblot.html

http://terms.naver.com/entry.nhn?cid=562&docId=295878&mobile&categoryId=562

http://www.piercenet.com/browse.cfm?fldID=8259A7B6-7DA6-41CF-9D55-AA6C14F31193

http://blog.naver.com/seoulinbio?Redirect=Log&logNo=60177194932