[Chapter 1] What is gene cloning and PCR? Why gene cloning and PCR are so important

모든 내용은 Gene Cloning and DNA Analysis, 6th edition, T.A.Brown, Wiley-Blackwell을 참고하여 작성하였습니다.

본 글의 제목은 언급된 도서의 각 챕터의 절 이름과 동일합니다.

대부분의 그림 역시 본 책에서 왔으며, 그 이외에는 따로 표시합니다.

도움이 되었다는 댓글 하나가 큰 힘이 됩니다!

Chapter 1

Why Gene Cloning and DNA Analysis are Important

 

 

1.3 What is gene cloning?

 Gene cloning: 원하는 gene을 vector에 삽입해 host cell에 도입한 후 세포 분열을 이용해 삽입된 gene을 복제하는 기법

The basic steps in gene cloning

① A fragment of DNA is inserted into a circular DNA molecule called a vector, to produce a recombinant DNA molecule.

② The vector transports the gene into a host cell, which is usually a bacterium.

③ Within the host cell the vector multiplies, producing numerous identical copies not only itself but also of the gene that it carries.

④ When the host cell divides, copies of the recombinant DNA molecule are passed to the progeny and further vector replication takes place.

⑤ After a large number or cell divisions, a colony, or clone, of identical host cells is produced.

Gene cloning 결과로 생겨난 한 클론의 세포들은 모두 하나 이상의 재조합 DNA 조각들을 가지며 동일한 유전적 특성을 공유함

Cloning vector로 이용되는 DNA 조각들은 host cell 내부로 들어갈 수 있어야 하고 스스로 자신을 복제할 수 있어야 함. 이를 만족시키는 plasmid, virus chromosome을 vector로 이용.

① Plasmid: 작은 원형의 DNA. 진정세균을 비롯한 일부 생물들(yeast)이 가지며, ori(origin of replication)를 가져 숙주 세포 내에서 스스로를 복제할 수 있음

② Virus chromosomes: 보다 정확히 하면 phage DNA. 세균에 감염하는 바이러스인 bacteriophage의 DNA는 숙주 세포의 단백질을 이용해 자신을 증폭시킴

1.4 What is PCR?

Gene cloning이 DNA fragment의 복제에 살아있는 세포를 이용한다면 PCR을 유전물질의 복제를 체외(in vitro)에서 가능하게 하는 기술

주형(template)이 되는 DNA, DNA 복제의 시작점을 지시하는 DNA primer (forward, reverse), 고온에서 활성을 가지는 DNA polymerase(pfu 혹은 taq), 그리고 새로이 신장될 DNA 가닥을 구성할 dNTP가 필요함

The basic steps in the polymerase chain reaction(PCR)

① Denaturation of the template DNA at 94℃. Two strands are separated.

② Annealing of the oligonucleotide primers at 50-60℃.

③ Synthesis of new DNA. DNA polymerase uses dNTPs as ingredients of new strands at 74℃.

④ Repeat the cycle 25-30 times.

PCR 결과 하나의 DNA 조각은 3000만~10억 개의 분자로 증폭됨

Template의 길이나 A/G 조성에 따라 각 단계의 소요 시간은 달라질 수 있음

 

1.5 Why gene cloning and PCR are so important

Gene cloning 혹은 PCR을 이용하면 원하는 유전자 하나만을 선택적으로 증폭시켜 얻어낼 수 있음

최근에는 설명된 방법들은 기반으로 한 보다 빠르고 정확한 gene cloning, PCR 방법이 개발되어 이용됨

① Obtaining a pure sample of a gene by cloning

보통 세포는 외부에서 한 종류만의 plasmid를 받아들이므로 여러 종류의 유전자를 각각 vector에 삽입 후 host cell에 한 번에 도입한다 해도 전체적으로는 각각 다른 유전자를 가진 여러 vector가 배지 상에 존재하나 이를 plate에 도말하여 single colony를 얻을 경우 각 colony는 한 종류의 vector만 가짐

항생제를 이용하는 등의 추가적인 방법을 이용하면 vector를 가진 cell만 선택적으로 골라낼 수도 있음

대장균(E. coli)이 4000여 개의 유전자를 가지고 있고 진핵생물은 그의 몇 십~몇 천 배의 개수의 유전자를 가지고 있는 점을 상기한다면 정확히 하나의 유전자만을 증폭해낼 수 있다는 것이 얼마나 중요한지 알 수 있음

② PCR can also be used to purify a gene

PCR을 할 때 증폭되는 부분은 두 개의 primer에 의해 결정됨

Gene cloning의 경우 selection(혹은 screening) 과정이 필요하지만 PCR은 primer에 의해 증폭되는 DNA의 부분이 정해져 있기 때문에 selection 과정이 필요하지 않으며, 몇 시간 안에 대량의 DNA를 얻어낼 수 있으므로 gene cloning보다 PCR이 간편한 편

단순히 실험 과정을 두고 보자면 PCR이 gene cloning보다 훨씬 간편하며 시간적으로도 효율적.

하지만 gene cloning이 계속해서 쓰이는 이유는 PCR의 두 가지 제한점 때문

① Primer를 만들기 위해서는 annealing site 서열을 알아야 하므로 아직 잘 연구되지 않은 유전자는 PCR 불가

② 척추동물들이 가지는 몇 십 kb 단위의 큰 유전자들은 한 번에 PCR 되기가 힘듦

즉, 아직 연구되지 않은 유전자나 긴 길이의 유전자를 복제하기 위해서는 gene cloning이 필수적임

(단, 다른 생물이 가진 유사 유전자의 서열을 안다면 primer를 만들어 PCR 수행 가능)

PCR은 유전자의 돌연변이 여부나 바이러스 감염 유무 검사, 법의학에서의 수사 등 다양한 분야에 응용됨