[Chapter 2] Plasmids

모든 내용은 Gene Cloning and DNA Analysis, 6th edition, T.A.Brown, Wiley-Blackwell을 참고하여 작성하였습니다.

본 글의 제목은 언급된 도서의 각 챕터의 절 이름과 동일합니다.

대부분의 그림 역시 본 책에서 왔으며, 그 이외에는 따로 표시합니다.

도움이 되었다는 댓글 하나가 큰 힘이 됩니다!

Chapter 2

Vectors for Gene Cloning: Plasmids and Bacteriophages

 

2.1 Plasmids

어떤 유전물질을 gene cloning의 vector로 사용하기 위해서는

① 숙주 세포 내로 들어가 스스로를 다량 복제할 수 있고 ② 크기가 적당해야 함

(10kb 미만. 그 이상이면 purification 등의 핸들링 과정에서 망가질 위험이 높음)

>> Plasmid and bacteriophage chromosomes

Features of plasmid

- Circular DNA molecule

- Host cell 내에 독자적으로 존재 가능

- Host cell에 유용한 하나 이상의 유전자를 가짐

- Host cell의 효소들을 이용해 스스로를 복제 가능(origin of replication 가짐)

- Episome(integrative plasmid)의 형태로 bacterial chromosome에 끼어드는 것도 존재

  (Bacterial chromosome에 끼어드는 것을 episomal plasmid, 끼어들지 않는 것을 non-integrated plasmid라 함)

실제로 plasmid를 이용할 때, 삽입하는 target gene 이외에 가장 중요한 요소들에는 세 가지가 있음

실험에 사용되는 모든 plasmid들이 공통적으로 가짐

① Origin of replication: host cell의 효소를 이용해 자신을 복제하기 위한 복제시작점

② Selection marker: gene cloning이 된 세포들만 선별해내기 위해 넣는 유전자. 보통 antibiotic resistant gene을 사용.

③ Restriction enzyme sites: 제한 효소로 vector의 한 부분과 target gene 양쪽 끝을 잘라내어 서로 붙이기 위해 필요. 상황에 맞게 이용할 수 있도록 다양한 RE 인식 서열들을 가짐.

Gene cloning의 궁극적인 목표가 원하는 gene을 많이 얻어내는 것이므로 plasmid의 자가 복제 능력, 즉 얼마나 많이 자신을 복제해낼 수 있느냐가 굉장히 중요

Size and copy number

Copy number: 일반적으로 하나의 bacterial cell 내에 존재하는 한 종류의 plasmid의 수
Plasmid 크기가 클수록 low copy number >> stringent plasmid
Plasmid 크기가 작을수록 high copy number >> relaxed plasmid

Copy number가 50이 넘어가면 high copy number plasmid (relaxed plasmid)라고 함

많은 plasmid를 얻기 위해 relaxed plasmid를 쓰는 것이 일반적

Copy number를 조절하는 정확한 인자가 무엇인지는 밝혀지지 않음

Conjugation

Conjugative plasmid: conjugation을 통해 한 세포에서 다른 세포로 자신을 복제시킬 수 있는 plasmid. 

Donor cell의 plasmid가 tra gene을 가진 경우에 가능. 

Conjugation이 가능한 것을 conjugative, 아닌 것을 non-conjugative plasmid라 함. 

기본적으로 non-conjugative plasmid는 다른 세포로 전달될 수 없지만 conjugative plasmid와 함께 한 세포 내에 존재할 경우 함께 다른 세포로 전달될 수도 있음

Compatibility

세포 외로부터의 plasmid 도입 혹은 conjugation 등을 통해 한 세포가 여러 종류의 plasmid들을 가질 수 있음

이 때 서로 다른 두 plasmid가 한 세포 내에 공존 가능하면 두 plasmid는 compatible하다고 함

반대로 두 plasmid가 한 세포 내에 공존할 수 없다면 두 plasmid는 incompatible하다고 함

이 경우 둘 중 하나는 제거되므로 두 종류 이상의 plasmid를 이용할 경우 incompatibility group의 분류에 기초하여 어떤 plasmid를 쓸 것인지를 계획해야 함

Compatibility를 조절하는 인자는 아직 밝혀지지 않았으나 plasmid replication 중에 요인이 있을 것으로 추정

Plasmid classification

어떤 유전자를 가졌는지에 따라서 plasmid를 분류할 수 있음

Fertility plasmid: F plasmid. Plasmid의 conjugal transfer를 일으키는 tra gene만을 가짐. E. coli에서 유래.

Resistance plasmid: R plasmid. 하나 이상의 항생제 내성 유전자를 가짐. 실험에서는 항생제로 screening을 하기 위해 중요하고, 임상적으로는 자연계에 존재하는 내성 유전자에 대한 정보로서 중요. 주로 Pseudomonas에서 유래.

Col plasmid: 다른 박테리아를 죽이는 colicin 단백질의 유전자를 지님. E. coli에서 유래.

Degradative plasmid: 일반적이지 않은 기질(ex: toluene)을 분해하는 효소를 암호화하는 유전자를 지님

Virulence plasmid: 숙주 세포가 독성을 가지게 하는 plasmid. (ex: Ti plasmid of Agrobacterium tumefaciens)

진정세균에서는 많은 종류의 plasmid들이 발견되었지만 진핵생물에서는 yeast에서만 몇 종류의 plasmid가 발견됨

진핵생물의 plasmid 발견은 유전공학에서 유용한 물질을 만들어내는 데에 매우 중요

다세포 생물(균류, 식물, 동물)에서는 plasmid가 발견되지 않음