[Chapter 5] Transformation, Identification of recombinants

모든 내용은 Gene Cloning and DNA Analysis, 6th edition, T.A.Brown, Wiley-Blackwell을 참고하여 작성하였습니다.

본 글의 제목은 언급된 도서의 각 챕터의 절 이름과 동일합니다.

대부분의 그림 역시 본 책에서 왔으며, 그 이외에는 따로 표시합니다.

도움이 되었다는 댓글 하나가 큰 힘이 됩니다!

Chapter 5

Introduction of DNA into living cells

 

좁은 의미에서의 cloning은 recombinant DNA를 host cell에 도입하여 증폭시키는 것

Cloning의 의의 ①: 매우 적은 양의 recombinant DNA를 수천~수백만 배로 증폭

Cloning의 의의 ②: 원하는 DNA fragment만을 얻을 수 있게 함 (purification)

Cloning 결과 vector에 삽입될 수 있는 분자들은

- Unligated vector molecules (mostly digested)

- Unligated DNA fragments (mostly digested)

- Self-ligated vector (insert 없이 원상태로 복구된 vector)

- Recombinant DNA with wrong insert DNA

- Desired recombinant DNA

이 중에서, 특히 아래의 세 가지 분자들 중에서 desired recombinant DNA만을 가진 colony를 선별하는 과정(selction or screening)이 필요

 

5.1 Transformation—the uptake of DNA by bacterial cells

Transformation : nonviral DNA

Conjugation : cell to cell

Transduction : viral DNA

자연계의 많은 세균들은 외부 DNA를 받아들일 능력이 있지만 그런 일이 일어날 확률은 매우 낮음

특정 균들은 transformation을 아주 쉽게 일으키지만 대부분의 경우 그렇지 않기 때문에 특별한 조작이 선행되어야 함

물리, 화학적인 처리에 의해 외부 DNA를 쉽게 받아들일 수 있게 된 세포를 competent cell(Co cell)이라 함

Preparation of competent E. coli cells

Competent cell을 만들기 위한 조건: 저온, 50mM CaCl2

영하의 온도에서 50mM CaCl2에 보관된 세포는 transformation에 적합하다고 알려짐

50mM CaCl2이 plasmid를 세포 표면에 침전시켜 붙게 하거나 세포벽에 어떤 변화를 일으킨다고 생각됨

여기에 42℃에서 1-2분의 heat shock을 주면 plasmid가 세포 내로 이동함. 정확한 이유는 알려지지 않음.

실제로 이렇게 transformation을 시행해도 효율은 굉장히 낮은 편(0.01%)

하지만 후에 배양, 증식 가능하므로 단 하나의 세포만 transformation에 성공해도 됨

Selection for transformed cells

수많은 colony 중에서 transformation된 0.01%의 colony를 찾기 위해 plasmid는 특별한 유전자를 추가로 가짐

Plasmid가 vector로서 가져야 하는 세 가지 조건을 되짚어보면,

- Origin of replication

- MCS (multiple cloning sites)

- Genes for selection or selection

이 중 마지막이 원하는 colony를 찾는 데에 사용됨

1970년대에 자연계에서 발견된 plasmid인 pBR322는 항생제인 ampicillin과 tetracycline에 각각 저항성을 가진 유전자를 하나씩 가짐

두 항생제에 내성이 있는 세포를 ampRtetR이라 하고, 내성이 없는 세포를 ampStetS라 함

배지에 amp 혹은 tet를 처리한 후 transformation 한 세포들을 도말해 배양하면 ampRtetR인 transformants는 colony를 형성하지만 ampStetS인 non-transformant는 살아남지 못하므로 쉽게 vector를 가진 세포만 selection 가능함

단, 세포가 내성 단백질을 발현하기 위해서는 어느 정도의 시간이 필요하므로 transformation 후 37℃에서 1시간 정도 incubation 후 항생제 포함 배지에 균을 키워야 함

 

5.2 Identification of recombinants

Transformation된, 즉 vector를 포함한 세포들은 위의 과정으로 selection 가능하나

- Self-ligated vector

- Recombinant DNA with wrong insert DNA

- Desired recombinant DNA

이들 사이에서 desired recombinant DNA를 가진 세포만 선별하는 과정이 필요함

Insertional inactivation: vector가 가지는 어떤 gene 서열 중간에 target gene을 삽입하여 기능 가능한 단백질 생산을 막음. 즉, 그 단백질 생산이 불가능한 colony가 원하는 DNA를 가짐을 알 수 있음.

Insertional inactivation of an antibiotic resistance gene

pBR322 vector는 amp, tet 저항성 유전자를 가짐 → amp, tet genes in vector (ampRtetR)

Target gene은 tet gene의 한가운데에 삽임됨 → amp, target genes in vector (ampRtetS)

 

1차 배양 시에 transformant들을 amp 함유 배지에 배양 → vector 가진 cell만 생존

2차 배양 시에 1차 배양 결과물에 대해 replica plating 시행하여 tet 함유 배지에 배양

→ target cell 삽입된 cell들은 생존 불가

1차 때의 amp 배지와 2차 때의 tet 배지를 비교해서 amp에만 존재하는 colony가 제대로 recombinant vector가 transformation된 것임을 알 수 있음

단, 방향성을 잘 표시해 복제본과 원본 대조가 쉽게 함. 복제는 주로 나무 블록이나 벨벳 천을 이용함.

Lac selection (α-complimentation)

pBR322를 이용한 selection은 두 번의 screening을 요구하므로 시간이 많이 걸림

→ 보다 간단한 lac selection 이용

pUC8 vector는 ampR과 lacZ’ gene을 가짐

lacZ’ gene: lactose를 분해하는 효소인 β-galactosidase의 일부만을 암호화하는 유전자

X-gal: Lactose analog. 흰색의 분자이나 β-galactosidase에 의해 분해되면 파란색을 띰

IPTG: Allolactose analog. lac operon의 inducer로 작용하고 allolactose와 달리 β-galactosidase에 의해 분해되지 않음

β-galactosidase의 또 다른 일부만 암호화하는 lacZ를 가진 host cell은 lacZ’ gene을 가진 pUC8가 있어야만 제대로 기능하는 β-galactosidase를 만들 수 있음

⟹ Modified lacZ gene (in host chromosome) + lacZ’ gene (in pUC8) = functional β-galactosidase

따라서 다음과 같은 selection&screening이 가능

① Vector를 가진 cell들은 ampR gene을 가져 amp 배지에서 살아남음

② Self-ligated vector를 가진 cell들은 lacZ’ gene을 가져 정상적인 효소를 만들므로 X-gal을 분해
→ blue colony

③ Recombinant vector를 가진 cell들은 lacZ’ gene이 망가졌으므로 효쇼를 만들지 못해 X-gal을 분해할 수 없음 → white colony