[Chapter 5] Introduction of phage DNA into bacterial cells, Identification of recombinant phages

모든 내용은 Gene Cloning and DNA Analysis, 6th edition, T.A.Brown, Wiley-Blackwell을 참고하여 작성하였습니다.

본 글의 제목은 언급된 도서의 각 챕터의 절 이름과 동일합니다.

대부분의 그림 역시 본 책에서 왔으며, 그 이외에는 따로 표시합니다.

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Chapter 5

Introduction of DNA into living cells

 

5.3 Introduction of phage DNA into bacterial cells

Recombinant DNA molecule을 bacteria가 아닌 virus, 그 중에서도 phage에 도입하기도 함

Phage는 bacterial cell에 감염하므로 plasmid 대신 사용할 수 있음

Transfection

Phage DNA를 bacterial cell에 도입하는 것

Plasmid 대신 phage DNA를 쓴다는 것만 제외하고 기본적인 개념은 transformation과 동일하다고 볼 수 있음

정제된 phage DNA를 Co cell과 섞어 heat shock으로 DNA를 세포 내로 도입시키는 것도 동일

(원래 transfection은 phage DNA를 bacterial cell에 도입함을 이르는 말이었으나 지금에 와서는 어떤 형태의 DNA든지 mammalian cell에 도입하면 transfection이라고 함. 원래의 의미로는 transduction을 대신 사용.)

In vitro packaging of λ cloning vectors

λ phage DNA 자체를 이용한 trasnsfection은 실제 λ phage를 이용한 infection에 비해 효율이 굉장히 떨어짐

실제 λ를 이용한 infection과 유사한 효과를 내기 위해 in vitro packaging을 이용

In vitro packaging: recombinant phage DNA + synthesized phage protein을 이용하여 원하는 DNA를 가진 phage를 조립하는 것

λ phage DNA는 약 49kb. 여기서 non-essential DNA region을 제거하고 target gene을 삽입할 수 있음

전체 크기가 49kb에 근접하면 phage는 이것을 자신의 DNA로 인식하고 정상적으로 packing하게 됨

① Single strain system: E. coli SMR10 - λ DNA
망가진 cos site를 가져 DNA replication과 packaging은 불가하나 다른 모든 서열을 정상적으로 가지므로 λ phage가 필요로 하는 모든 단백질은 합성 가능
합성된 단백질과 recombinant λ DNA를 이용해 in vitro packaging 가능

② Double strain system: E. coli BHB2688 - λ defective for synthesis of protein E (λ E- strain)
E. coli BHB2690 - λ defective for synthesis of protein D (λ D- strain)
이용되는 두 개의 균주 모두 각각 다른 유전자 하나에 대해 mutation이 존재
모든 단백질이 없으므로 lytic cycle 없이 단백질 생산만 일어남
Cell lysate를 합치면 모든 단백질이 존재하는 상태가 됨

두 가지 경우에서 모두 phage particle이 얻어지고, 여기에 원하는 gene을 가지는 recombinant λ DNA를 섞어주어 infective λ phage를 만들고 E. coli에 감염시켜 원하는 recombinant DNA를 대량으로 얻을 수 있음

Phage infection is visualized as plaques on an agar medium

Phage infection의 마지막 단계는 cell lysis

고체 배지 위에 균일하게 자라난 세균(a lawn of bacteria) 중 cell lysis에 의해 깨진 것들은 배지 상에서 투명한 plaque로 나타남

Plaque 형성 = 감염 성공 = plaque 내에 cell lysate, phage particle 존재

Lytic cycle이냐 lysogenic cycle이냐에 따라서 plaque는 다르게 형성됨

① λ phage: Lytic cycle만 가지기 때문에 깨끗한 plaque 형성 (clear plaque)

② M13 phage: Lysogenic cycle만 가지기 때문에 세포가 터지지 않고 세포 분열 속도만 늦춰지므로 혼탁한 plaque 형성 (turbid plaque)

 

5.4 Identification of recombinant phages

Recombinant가 일어난 phage와 일어나지 않는 phage가 감염한 두 경우를 구분하기 위한 여러 방법들

Insertional inactivation of a lacZ' gene carried by the phage vector

모든 M13 phage와 일부 λ phage는 lacZ' gene를 가지며, 여기에 target gene이 삽입됨

박테리아의 blue white screening과 유사. 배지에는 X-gal과 IPTG 첨가.

Recombinant: lacZ' gene 파괴되므로 X-gal 분해 불가 → white plaque

Non-recombinant: lacZ' gene 유지되므로 X-gal 분해 가능 → blue plaque

Plaque 이외의 부분(lawn)에 있는 균들은 phage lacZ' gene을 안 가지고 있으므로 X-gal 분해 불가

Insertional inactivation of the λ cI gene

cI gene을 가진 λ phage 이용

Recombinant: cI gene 파괴되므로 lytic cycle만 허용 → clear plaque

Non-recombinant: cI gene 유지되므로 lysogenic cycle 진행 → turbid plaque

Selection using the Spi phenotype

Spi gene을 가진 λ phage는 Spi+로, P2 phage가 이미 감염한 세포에는 감염하지 못함

충분한 양의 P2 phage로 박테리아들을 감염시킨 후 λ phage를 2차로 감염시키면

Recombinant: Spi gene이 망가져 Spi-가 됨 → 감염 가능

Non-recombinant: Spi gene을 가져 그대로 Spi+ → 감염 불가

즉 재조합 DNA를 가진 phage만 감염이 가능하도록 함

Selection on the basis of λ genome size

전체 genome 길이가 49kb 정도인 λ phage는 37~52kb 사이의 DNA만 조립해 넣을 수 있음

Vector 길이는 37kb보다 작게, recombinant는 49kb 정도로 맞춤

Recombinant: DNA가 올바르게 packaging 됨 → phage production

Non-recombinant: DNA가 packaging 되지 못함 → no phage production