[Chapter 4] Ligation – joining DNA molecules together

모든 내용은 Gene Cloning and DNA Analysis, 6th edition, T.A.Brown, Wiley-Blackwell을 참고하여 작성하였습니다.

본 글의 제목은 언급된 도서의 각 챕터의 절 이름과 동일합니다.

대부분의 그림 역시 본 책에서 왔으며, 그 이외에는 따로 표시합니다.

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Chapter 4

Manipulation of Purified DNA

 

4.3 Ligation – joining DNA molecules together

Restriction endonuclease를 이용한 vector와 insert DNA가 준비되었으면 두 분자를 붙이는 과정이 필요

⇒ Ligation

The mode of action of DNA ligase

DNA의 discontinuity라는 것은 phosphodiester bond가 끊어진 것을 말함(수소결합으로 붙어있어도)

세포 내에는 이러한 끊어짐을 복구하기 위한 ligase가 존재

(Nick: 한 두 개의 nt가 빠진 것 / Discontinuity: nt는 모두 있으나 DNA backbone의 bond가 끊어진 것)

Blunt end, sticky end 모두 복구 가능

Vector와 insert DNA는 ligase에 의해 연결될 수 있음

Ligation을 위해서는 3’-OH와 5‘-PO32-가 필요

T4 DNA ligase를 이용한 ligation은 4℃~20℃에서 좋은 활성을 보임. ATP가 필요함

Ligation 과정에서 ①recombinant DNA ②self-ligated vector ③series of vectors or inserts 등이 얻어짐

후에 seletion과 screening 과정을 통해 우리가 원하는 recombinant DNA만 얻어낼 수 있음

Self-ligation 가능성을 줄이기 위해서 single cut보다는 double cut이 선호됨

Alkaline phosphatase ligation

RE single cut을 할 때는 phosphatase를 처리해 vector의 5‘-PO32-를 5’-OH로 치환, 나중에 self-ligation이 되지 않도록 함. Insert는 정상적인 말단을 가지고 있으므로 vector와 insert는 ligation에 의해 연결될 수 있고, 이 결과 두 군데의 discontinuity는 그대로 남아있지만 E. coli 내부에서 수선될 수 있음

Sticky ends increase the efficiency of ligation

Sticky end는 서로 상보적인 서열을 가지므로 수소결합에 의해 쉽게 붙을 수 있어 ligation이 쉬움

반면 blunt end는 붙이고자 하는 두 분자 사이의 추가적인 인력이 없어 ligation이 반응물의 농도에 의존적임

일반적인 경우에는 sticky end를 이용하며, DNA의 농도가 높을 때만 제한적으로 blunt end를 사용

Putting sticky ends onto a blunt-ended molecule

Sticky end의 효율이 blunt end보다 훨씬 높기 때문에 보통 sticky end를 사용하지만 vector와 insert 중 하나가 blunt end로 얻어졌을 경우 양쪽 끝을 sticky나 blunt end 중 하나로 맞춰주는 것이 필요함

Klenow fragment (blunt end)

5’ overhang을 가진 분자는 Klenow fragment를 이용해 blunt end를 만드는 것이 가능

Linker (sticky end)

가운데에 sticky end를 만드는 RE의 recognition site를 가진 blunt linker를 과량 첨가한 후 ligation

해당 RE를 처리하면 DNA 양쪽으로 sticky end가 만들어짐

단, DNA 자체에 해당 RE에 인식되는 부분이 없어야 함

Adaptor (sticky end)

한 쪽은 조작된 sticky end, 한 쪽은 정상적인 blunt end를 가지는 oligonucleotide. Sticky end는 5‘-PO32- 대신 5‘-OH를 가져 adaptor끼리의 sticky end를 통한 self ligation이 불가. Blunt-ended DNA에 adaptor를 과량 첨가한 후 ligation하면 sticky end가 만들어짐

RE를 사용하지 않으므로 DNA 내의 RE 인식 서열과 무관하게 이용 가능

Homopolymer tailing (sticky end)

Vector와 terminal transferase, dCTP를 섞어 vector에 poly(dC) tail을 만들고, insert DNA와 terminal transferase, dGTP를 섞어 insert DNA에 poly(dC) tail을 만들면 둘을 서로 상보적인 서열을 가지게 되므로 쉽게 붙음

단, 두 tail의 길이는 서로 다를 수 있으므로 Klenow polymerase를 이용해 nick을 메워주는 작업이 필요
(Tail 길이가 20base를 넘어가면 두 번째 단계를 생략하고 바로 세포에 도입해 nick을 메우는 것도 가능)

DNA topoisomerase (blunt end)

언급된 방법들 중 가장 간단하고 효율적인 방법. DNA topoisomerase가 nuclease와 ligase 기능을 모두 가지는 것을 이용. Vaccinia virus에서 유래한 vaccinia topoisomerase와 CCCTT 서열을 가지는 vector가 필요

Alkaline phosphatase로 처리된 insert DNA는 모든 말단에 OH를 가짐

Vaccinia topoisomerase는 vector의 CCCTT를 blunt end로 자른 상태로 vector와 공유 결합해 있음

이 상태로 반응을 일시 정지시킨 뒤 insert DNA를 topoisomerase-vector에 집어넣고 반응을 다시 개시하면 topoisomerase가 vector와 insert DNA를 연결하고 반응이 종료됨

두 군데의 discontinuity는 후에 세포 내에서 복구됨