[Chapter 3] Preparation of bacteriophage DNA

모든 내용은 Gene Cloning and DNA Analysis, 6th edition, T.A.Brown, Wiley-Blackwell을 참고하여 작성하였습니다.

본 글의 제목은 언급된 도서의 각 챕터의 절 이름과 동일합니다.

대부분의 그림 역시 본 책에서 왔으며, 그 이외에는 따로 표시합니다.

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Chapter 3

Purification of DNA from Living Cells

 

3.3 Preparation of bacteriophage DNA

Phage DNA purification은 cell extract 대신 phage particle을 재료로 함
Bacteria+phage culture를 centrifugation 하여 세포는 가라앉히고 phage는 상층액으로 분리하는 것이 기본

Purification of bacteriophage DNA (λ phage)

High titer를 얻기 위해서는 phage를 lysogenic이 아닌 lytic cycle로 들어가게 하는 작업(induction)이 필요

① λ phage를 lysogenic cycle에 머무르게 하는 유전자인 cI gene에 temperature-sensitive (ts) mutation이 생기면 42℃ 이상의 온도에서 lysogenic cycle의 유지가 불가능
즉, 30℃에서 phage를 배양하다 온도를 42℃로 올림으로써 대량의 phage를 한 번에 얻을 수 있음

② cI gene이 없어 lytic cycle만 가지는 일부 λ strain의 경우는 초기에 넣어주는 phage 수를 조절해야 함
너무 낮은 세균 밀도 → 모든 세포들이 너무 빠르게 죽음 → low phage titer
너무 높은 세균 밀도 → 세포 분열 속도가 phage 감염 속도보다 빠름 → low phage titer
Cell : virus = 1:2 → 적당한 세포 분열 후 모든 세포가 감염됨 → high phage titer

Lysed bacterial cells + phage particles의 혼합물은 centrifugation

Phage가 포함된 supernatant만 분리, 이를 polyethylene glycol(PEG)과 NaCl에 섞어 다시 centrifugation 하여 침전시킴. PEG가 NaCl solution 상에서 물을 흡수해 큰 분자들과 함께 침전됨을 이용하며, 후에 phenol extraction을 이용해 capsid를 제거해 DNA만을 얻어냄

Supernatant에도 cell debris가 섞여있을 수 있으므로 좀 더 순수하게 정제하기 위해서는 CsCl density gradient centrifugation을 시행 (λ phage particle density=1.45~1.50)

Purification of bacteriophage DNA (M13 phage)

Host cell lysis를 일으키는 λ phage와 달리 M13 phage는 세포 밖으로 계속해서 secretion 되므로 ① 쉽게 high titer를 얻을 수 있고 ② cell debris가 섞일 우려가 없으며 ③ ssDNA와 dsDNA 모두를 얻을 수 있다는 추가적인 이점을 가짐

dsDNA를 얻는 것은 plasmid DNA purification과 동일한 과정을 요구

ssDNA를 얻는 것은 λ phage DNA purification과 동일한 과정을 요구 (CsCl density gradient centrifugation불필요)