[생명과학/실험] Inhibiting the action of catechol oxidase

Date

2011. 3. 22

Subject

to learn a noncompetitive inhibition and experiment the effect of PTU in activity of catechol

Abstract

An inhibitor is the molecule that interacts with the enzyme then reduce its activity. There are three kinds of inhibitor: competitive inhibitor, noncompetitive inhibitor and uncompetitive inhibitor.  

First, a competitive inhibitor interacts with the enzyme at the active site where the substrates interact with the enzyme. Because both inhibitor and substrate effect at the active site, they are 'competitive' to each other. When a inhibitor exist, the velocity of generating products decreases. If the inhibitor is a competitive inhibitor, the more concentration of substrates can overcome the decrease of the velocity.

Secondly, a noncompetitive inhibitor operates at the regulatory site so it does not have to compete with the substrates. If the noncompetitive inhibitor exists, the decrease of the velocity can overcome with the more enzymes, but not the more substrates.

Thirdly, a uncompetitive inhibitor interacts with enzyme-substrate complex so both enzyme and substrates cannot be used anymore. Only more substrates and enzymes are required to overcome it.

Phenylthiourea(PTU) is the noncompetitive inhibitor of catechol oxidase. It interacts with the Cu in the enzyme then the enzyem cannot operate anymore. Through this experiment, we can learn what is noncompetitive inhibitor and the dffect of PTU as the noncompetitive inhibitor to catechol oxidase.

Procedure

1. Using Table 1, prepare the three experiment tubes. Be sure to add solution in the sequence given in the table. (water first, potato extract next, PTU next, etc.)

<Table 1>

tube	d.w.	potate extract	PTU	d.w.	catechol
1	5ml	0.5ml	0.5ml	0.5ml	0.5ml
2	5ml	0.5ml	0.5ml	-	1ml
3	5ml	0.5ml	-	1ml	0.5ml

2. Observe the reactions in the tubes and record your observation in the result section below. Explain your conclusion in the discussion section.

Results

Results of inhibition of catechol oxidase activity by PTU experiment

<Table 2>

tube	1	2	3
color (+ or -)	+	+	+++

Discussion

1. Why was the concentration of catechol increased in test tube 2?

  만약 PTU가 competitive inhibitor라면 substrate인 catechol의 concentration이 증가했을 때 PTU에 의한 product 생성 속도가 증가해야 한다. Substrate가 inhibitor보다 enzyme에 결합할 확률이 높아지기 떄문이다. 반면 PTU가 noncompetitive inhibitor라면 substrate의 concentration에 상관없이 enzyme에 결합하여 activity를 감소시킬 것이다. 실험 결과에 따르면 tube 2에서 catechol의 concentration이 증가했는데, tube 1과 tube 2의 색차는 tube 3과의 색차에 비하면 매우 작다. 두 tube의 product가 비슷한 양으로 생산되었다고 본다면, PTU는 substrate의 concentration에 상관없이 작용하는 noncompetitive inhibitor라고 볼 수 있다. 즉, tube 2에 catechol을 더 넣은 것은 PTU가 competitive inhibitor인지 noncompetitive inhibitor인지를 알아보기 위한 것이다.

2. Why should the catechol be added to the test tubes last?

  우리가 실험에서 변화를 주고자 한 조건은 ①PTU의 유무 ②catechol concentraion이다. 따라서 catechol의 concentration을 potato extract와의 반응때 맞추어야 하므로 최종 volume을 정하는 마지막 순서에 catechol을 넣은 것이다. 또한 catechol을 PTU보다 먼저 넣으면 tube 1, 2에서 PTU 없이, 즉 inhibitor 없이 반응이 먼저 일어나버리기 떄문에 PTU에 의한 영향을 제대로 파악할 수 없다. 따라서 PTU와 potato extract를 먼저 넣은 후 최종적으로 catechol을 넣어 concentration을 맞춰주고 PTU가 제대로 inhibition을 할 수 있도록 하는 것이다.

3. Discuss the activity of the phenylthiourea(PTU).

  먼저, PTU 처리를 한 tube 1, 2에서 browning이 적게 일어나는 것으로 보아 PTU는 product 생산을 저해하는 inhibitor로 작용함을 알 수 있다. 또한 discussion 문항 ①에서 논의한 바와 같이 tube 1, 2에서 catechol의 concentration이 변화했는데도 catechol oxidase의 activity는 비슷하다는 점에서 PTU는 substrate의 concentration에 영향을 받지 않고 enzyme과 상호작용하는 물질임을 알 수 있다. 즉, 이들을 종합해볼 때 phenylthiourea는 catechol oxidase에 대해 noncompetitive inhibitor로 작용함을 알 수 있다.

4. Why there are some difference of concentration of benzoquinone between tube 1 and tube 2?

  Inhibitor와 enzyme도 언제나 100%의 확률로 결합하는 것은 아니다. Inhibitor가 enzyme에 일부 결합했을 때, 나머지 enzyme은 substrate와 결합할 여지가 남아있다. 따라서 substrate의 concentration이 tube 2에서 증가했을 때, 약간이나마 substrate와 enzyme의 interaction이 일어날 확률이 높았을 것이다. 그래서 tube 1과 tube 2에서 미묘하지만 benzoquinone의 concentration 차이에 의한 색깔 차이가 생긴 것이다.

References

「Biology」, BIOSCIENCE, 2007. 2. 27, p.156-157, 2011. 3. 23 

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