[Chapter 3] Preparation of total cell DNA

모든 내용은 Gene Cloning and DNA Analysis, 6th edition, T.A.Brown, Wiley-Blackwell을 참고하여 작성하였습니다.

본 글의 제목은 언급된 도서의 각 챕터의 절 이름과 동일합니다.

대부분의 그림 역시 본 책에서 왔으며, 그 이외에는 따로 표시합니다.

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Chapter 3

Purification of DNA from Living Cells

 

3.2 Preparation of plasmid DNA

Plasmid를 준비하는 과정은 total DNA를 준비하는 과정과 매우 유사
Cell extract를 만드는 과정에서 plasmid DNA와 bacterial DNA가 분리되는 과정이 필요함

→ Size와 conformation 차이를 이용

Bacterial DNA: big and circular, but linear after cell extraction

Plasmid DNA: small and circular (or supercoiled)
Separation on the basis of size

① Bacterial chromosome은 cell envelope에 붙어있는 circular DNA
Plasmid는 세포 내에 자유롭게 존재하는 circular DNA (actually, supercoiled)

② Lysozyme, EDTA, 25% sucrose를 넣으면 세포벽이 일부 깨지며(lysozyme, EDTA) 세포 모양은 유지되는(sucrose) sphaeroplast가 됨. 이는 cell envelope에 붙어있는 chromosomal DNA가 작게 잘라지는 것을 막기 위해서임 ← cell wall breaking

③ Triton X-100 등의 non-ionic detergent를 처리하여 세포막을 붕괴시킴 ← cell membrane denaturation

④ 최소한으로 잘린 chromosome 조각들을 제거하기 위해 centrifugation
- Cleared lysate: plasmid and chromosomal DNA / pellet: chromosomal DNA attached to cell debris

이렇게 얻어진 것의 cleared lysate는 상층부에 plasmid, 하층부에 chromosomal DNA를 가지긴 하나 작게 잘려버린 chromosomal DNA가 상층부에 포함될 수도 있음

또한 plasmid 자체가 클 경우 cell debris와 함께 침전되기도 하므로 크기를 기준으로 한 DNA separation은 한계점을 가짐

Separation on the basis of conformation

Plasmid는 보통 topoisomerase에 의해 supercoiled form, 즉 covalently closed-circular (ccc) DNA 형태로 존재

Plasmid에 nick이 생길 경우 open-circular (oc) form으로 존재

이 중 supercoiled form은 분리하기도, 이용하기도 용이함

Alkaline denaturation

Plasmid DNA는 망가지지 않지만 chromosomal DNA는 망가지는 좁은 pH 범위 존재 (pH12.0~12.5)

① NaOH로 pH12를 만들면 수소결합이 깨지므로 chromosome은 single strands가 되나 supercoiled plasmid는 그 물리적인 구조 때문에 나선이 풀리지 못함

② Sodium acetate를 첨가해 다시 pH를 7.0으로 돌리면 수소결합이 회복되어 plasmid는 복구되지만 chromosome은 갑작스러운 pH 변화에 제대로 붙지 못하고 엉겨 붙어 흰 침전 형성

이 과정에서 RNA, protein도 망가져 함께 pellet으로 침전됨

단, nick form도 함께 얻어질 가능성 있음

EtBr-CsCl density gradient centrifugation

CsCl solution을 centrifugation (20000rpm, 24h) 시켜 생긴 농도 차이로 protein, RNA, DNA를 분리

Buoyant density: CsCl=1.55~1.80(g/㎤) / protein‹1.55 / RNA›1.80 / DNA≃1.70
여전히 DNA 층에는 supercoiled DNA와 non-supercoiled molecules이 섞여 있으므로 EtBr을 첨가

EtBr은 DNA의 bp 사이에 끼어들므로 이에 따라 DNA의 밀도가 감소

Linear or oc DNA에는 EtBr이 쉽게 끼어들지만 (밀도 0.125 감소) ccc DNA에는 EtBr이 잘 들어가지 않으므로 (밀도 0.085 감소) 이렇게 발생하는 밀도차를 이용해 CsCl solution 상에서 두 층을 분리해낼 수 있음

UV 아래서 빛나는 EtBr을 포함한 ccc DNA를 주사기로 뽑아내고 n-butanol로 추출한 뒤 dialysis로 CsCl을 제거하면 고순도의 supercoiled plasmid를 얻을 수 있음

Plasmid amplification

최근에는 high copy number를 가진 plasmid를 흔히 쓰지만 과거에는 그런 plasmid들이 흔치 않았음

일부 plasmid의 경우, chloramphenicol과 같은 세포 내 protein 합성을 막는 약물을 저농도로 처리하여 12h 정도 배양하면 크기 신장, 염색체 복제가 불가능해 세포분열은 일어나지 않지만 plasmid만 복제됨이 알려짐

이를 이용, 20 정도의 copy number를 수 천 단위까지 증폭 가능