[Chapter 4] The range of DNA manipulative enzymes

모든 내용은 Gene Cloning and DNA Analysis, 6th edition, T.A.Brown, Wiley-Blackwell을 참고하여 작성하였습니다.

본 글의 제목은 언급된 도서의 각 챕터의 절 이름과 동일합니다.

대부분의 그림 역시 본 책에서 왔으며, 그 이외에는 따로 표시합니다.

도움이 되었다는 댓글 하나가 큰 힘이 됩니다!

Chapter 4

Manipulation of Purified DNA

 

Gene cloning을 위해서는 DNA sample을 ‘자르고 붙여’ 원하는 recombinant DNA를 만들어야 함

이를 가능하게 하는 것이 restriction endonucleases와 ligases

과거에는 화학적 방법으로 아주 제한적으로 이루어졌던 작업이 순수하게 분리된 enzyme 덕분에 매우 편리하게 이루어지고 있음

 

4.1 The range of DNA manipulative enzymes

DNA manipulative enzyme의 큰 분류

Nucleases: cut, shorten, or degrade nucleic acid molecules

Ligases: join nucleic acid molecules together

Polymerase: make copies of molecules

Modifying enzymes: remove or add chemical groups.

Topoisomerases: introduce or remove supercoils from covalently closed circular DNA

몇몇 효소들은 여러 기능을 가지기도 함 (ex: pol+nuclease)

RNA에 작용하는 유사 효소들도 존재

Nuclease

DNA backbone의 phosphodiester bond를 끊는 효소. Nuclease에 DNA를 오래 노출시킬수록 더 많이 잘림

Exonuclease: DNA 분자의 끝에서부터 가닥을 잘라내는 nuclease
Bal31: dsDNA의 양쪽 가닥을 동시에 잘라냄
E. coli exonuclease III: dsDNA를 3‘ terminus부터 잘라냄

Endonuclease: DNA 분자의 중간을 자르는 nuclease
S1 nuclease: ssDNA의 중간을 자름 (dsDNA의 nick 부분의 ssDNA도 자를 수 있음)
DNase I: ssDNA, dsDNA의 중간을 자름
Restriction endonuclease: dsDNA의 특정 부분(recognition site)을 인식하여 특정 모양으로 자름. Gene cloning에 있어서 핵심적으로 이용되는 nuclease

Ligase

끊어진 두 가닥의 DNA 사이에 phosphodiester bond를 다시 만들어주어 두 가닥을 잇는 효소

dsDNA의 single-stranded breaks(discountinuities)을 잇는 것과 dsDNA 두 분자를 잇는 것이 있음

Polymerase

Nucleotides를 이용해 template에 상보적인 가닥을 합성하는 효소

대부분의 polymerase들은 primer로 기능하는 double-stranded region이 있어야 전사를 개시할 수 있음

DNA polymerase I: E. coli 유래. Pol+exonuclease. ds region 뒤의 ss region이나 nick에서 전사를 시작하며, 진행 방향에 본디 존재했던 가닥이 있으면 그것을 잘라내고 새로운 가닥을 합성함

Klenow fragment: DNA pol I에서 exonuclease 기능을 제거한 것

Taq DNA pol: 호열균인 Thermus aquaticus에서 유래한 고온 활성(72℃ 이상)을 가진 효소. 작용 기작은 Klenow fragment와 동일. PCR에 많이 이용됨

Reverse transcriptase: RNA를 template로 하여 DNA를 합성. cDNA cloning에 이용됨

DNA modifying enzyme

DNA에 특정한 작용기를 붙이거나 떼어내는 효소

Alkaline phosphatase: 5’-PO32-를 5‘-OH로 치환. 그 결과 5‘-OH 뒤로는 다른 nucleotide가 붙지 못함

Phlynucleotide kinase: 5’-5‘-OH를 PO32-로 치환. Alkaline phosphatase의 역반응을 일으키는 효소

Terminal deoxynucleotidyl transferase: 3‘-OH에 dNTP를 무작위로 붙여나감. Template 필요 없음