[Chapter 4] Enzymes for cutting DNA – restriction endonucleases

모든 내용은 Gene Cloning and DNA Analysis, 6th edition, T.A.Brown, Wiley-Blackwell을 참고하여 작성하였습니다.

본 글의 제목은 언급된 도서의 각 챕터의 절 이름과 동일합니다.

대부분의 그림 역시 본 책에서 왔으며, 그 이외에는 따로 표시합니다.

도움이 되었다는 댓글 하나가 큰 힘이 됩니다!

Chapter 4

Manipulation of Purified DNA

 

4.2 Enzymes for cutting DNA – restriction endonucleases

Cloning을 위해서는 vector와 gene을 정확히 자르는 것이 필요 → restriction endonuclease 사용

Vector로 이용되는 plasmid는 RE 인식 부위를 여러 종류 가지되 종류별로 하나씩의 인식 부위만을 가져야 함

Target gene은 ①vector에 들어가고 ②다루는 과정에서 부서지지 않기 위해서 작은 크기(8kb 이하)로 잘려야 함

The discovery and function of restriction endonucleases

Host-controlled restriction: Bacteria는 RE를 발현하여 bacteriophage의 DNA를 잘라버림. 일종의 방어 체계
RE는 특정 서열을 인식하여 DNA를 자르지만 host chromosome은 일정 패턴을 가지고 methylation 되어 있기 때문에 RE에 인식되지 않아 안전함

RE는 해당 서열을 인식하는 methylase를 짝으로 가짐

Restriction endonuclease는 크게 세 종류로 나뉨

Type II restiction endonucleases

Type II enzyme은 methylase와 nuclease가 따로 존재

대부분 recognition site의 DNA를 자르기 때문에 이용하기 편함(type I의 경우 인식 자리의 1000bp 앞을 자름)

보통 인식 자리는 4-8개의 nucleotide이며, 6개짜리가 보통. 인식 서열이 palindromic sequence인 경우가 많음

EcoRI, BanHI, PvuI, HindIII 등이 대표적인 type II RE

Blunt ends and sticky ends

RE가 DNA를 자르는 모양에 따라 그 끝부분의 모양을 분류할 수 있음

① Blunt end (flush end): 인식 부위의 정중앙이 잘림. 수소결합의 끊어짐 없이 backbone만 끊어짐

② Sticky end (cohesive end): 인식 부위의 여러 bp들이 잘려 떨어짐. 수소결합과 backbone 모두 끊어짐
5‘ overhang: 5’ terminus가 길게 잘린 모양
3’ overhang: 3‘ terminus가 길게 잘린 모양

5‘ overhang의 경우, 반대쪽 가닥이 primer로 작용하여 DNA가 합성되면 blunt end로 바뀔 수 있음

같은 서열을 인식하지만 다르게 자르는 경우(isoschizomer), 혹은 같은 overhang을 만들지만 인식 서열은 다른 경우 등이 있음. 대표적인 경우가 BamHI, BgIII, Sau3A

세 효소는 같은 overhang을 만들므로 세 효소에 의해 잘린 산물은 서로 같은 sticky end에 의해 붙을 수 있음

하지만 붙은 후에는 overhang을 포함한 전체 인식 서열이 달라질 수 있으므로 다시 한 번 같은 효소로 잘릴 수는 없음 (단, Sau3A는 4개의 인식서열을 가지므로 가능할 수도 있음)

Dam and Dem methylation

Host chromosome을 RE로부터 보호하기 위한 대표적인 두 methylation

① Dam methylation: Dam이라는 methylase가 5‘-GATC-3’의 A의 N6 position에 methylation을 일으킴
RE에 의한 소화를 막고 DNA replication에도 관여하는 것으로 알려짐

② Dcm methylation: Dcm라는 methylase가 5‘-CCWGG-3’의 안쪽 C의 C5 position에 methylation을 일으킴
(W는 A 혹은 T)

RE 중에서도 methylation에 민감한 효소가 있고 민감하지 않은 효소가 있음

MboI는 Dam methylation 부위를 자르지 못하나 Bsp143I는 Dam methylation 부위를 자를 수 있음

The frequency of recognition sequences in a DNA molecule

Restriction site는 DNA 상에 균일하게 분포해 있지 않으며, 그 존재 빈도도 실제 수학적 확률과는 다름

RE에 인식되는 hexanucleotide는 확률적으로 46=4096 nucleotides마다 한 번씩 등장해야 함

이 계산에 따르면 49kb 크기 λ DNA에는 6자리 인식 서열들이 12개씩 등장해야 하나, 실제로는 그보다 훨씬 적은 경우가 많음. 또한 그 분포도 일정하게 분산되기 보다는 몰려있는 경우가 많음

여러 가지의 RE를 하나씩 혹은 동시에 처리해서 그 조각들의 길이를 바탕으로 RE map을 만들 수 있음

Performing a restriction digest in the laboratory

1 unit of RE: 1ug DNA를 1h에 모두 자를 수 있는 RE 양. 10U라면 10ug DNA를 1h에 자를 수 있음

효소에 따라 너무 과량을 사용하면 overactivation 되어 원래의 인식 서열 이외의 부분을 자를 수도 있음

Restriction digest를 위해서는 자를 DNA, RE, buffer, ddw(최종 농도를 맞추기 위함)가 필요

10X buffer의 조성

Tris-HCl (pH7.4) 500mM: 적절한 pH 제공

MgCl2 100mM: Type IIRE 활성을 위한 필수 요소

NaCl 500mM: Ion 농도 조절을 위함

DTT 10mM: Reducing agent로 효소를 안정화시킴

보통의 효소들은 이와 같은 환경에서 잘 작동하지만 TaqI(65℃에서 작동) 등 일부 효소들은 다른 환경을 요구

Unit이 다를 경우 시간 혹은 RE/DNA 비율을 조절할 수 있음

4 units/ul인 BglII를 이용할 경우 restriction digest 과정은 다음과 같음

Digestion이 일어난 후 가장 마지막 단계는 enzyme을 제거하는 것. 70℃의 고온과 phenol, EDTA(Mg2+ chelating)을 이용해 enzyme을 제거함

Analyzing the result of restriction endonuclease cleavage

RE cleavage 결과를 확인하기 위해 gel electrophoresis를 시행

조밀한 격자 구조의 gel 안에서 DNA가 정전기적 인력에 의해 끌려오는 정도가 DNA의 길이에 따라 다르게 나타나는 것을 이용

DNA backbone이 인산기를 가지므로 DNA는 전체적으로 음전하를 띰

여기에 전류를 걸어주면 (+)쪽으로 DNA가 전진하는데, 길이가 긴 DNA는 짧은 DNA보다 더 큰 점성을 나타내므로 상대적으로 느리게 gel에서 이동함

0.5% Agarose gel: 한천(agar)로 만들며 DNA 분리에 주로 쓰임(1-30kb)

40% PAG(polyacrylamide gel): Polyacrylamide로 만들며 보다 작은 구멍을 가져 protein과 작은 DNA(1-300bp) 분리에 이용. 유독성

DNA의 실제적인 위치를 알기 위해 DNA를 UV 아래에서 확인할 수 있도록 전기영동이 끝난 gel을 옅은 EtBr solution에 담가 염색함

EtBr은 유독하며 sensitivity가 그리 높지 않기 때문에 최근에는 다른 종류의 염색약을 많이 이용함

길이가 이미 알려진 linear DNA들이 들어있는 DNA marker(or DNA ladder)를 이용해 DNA 크기 확인 가능

혹은 gel 상에서 DNA가 이동한 거리를 측정하여 특정 band의 DNA의 크기가 얼마인지를 계산할 수 있음

⇒ D=a-b(logM) (D: DNA 이동 거리 / a: gel에 따라 다른 상수 / b: gel 농도 / M: DNA 분자량)

DNA의 크기가 커질수록 DNA 사이의 간격이 좁아지므로 해상도가 떨어짐

Orthogonal field alternation gel electrophoresis(OFAGE)는 대각선 방향으로 전압을 걸어줌으로써 짧은 DNA는 빠르게 방향을 바꾸어 이동하고 긴 DNA는 느리게 방향을 바꾸어 천천히 이동하게 하여 해상력을 크게 높임

OFAGE를 이용하면 수백kb~수천kb의 DNA를 분리해낼 수 있음

Contour clamped homogeneous electric fields (CHEF), field inversion gel electrophoresis (FIGE)는 염색체 단위의 커다란 DNA 분자도 분리해낼 수 있음

Mapping the positions of different restriction sites in a DNA molecule

Restriction map을 이미 알고 있을 때 원하는 곳을 원하는 효소로 정확하게 자를 수 있음. 즉 Restriction map이 먼저 만들어져야 함

Single digest: 한 종류의 RE로 DNA를 자르는 것. 너무 많은 조각이 나온다면 digestion 조건을 바꿔 효율을 낮추는 partial digestion을 통해 만들어지는 조각의 수를 줄여 결과 해석을 도울 수 있음

Double digest: 두 종류의 RE로 DNA를 자르는 것. 두 효소의 활성 조건에 따라 buffer를 맞춰야 하며, 그것이 불가능할 경우 순차적으로 digestion을 시행할 수 있음