[Chapter 6] Cloning vectors based on λ bacteriophage

모든 내용은 Gene Cloning and DNA Analysis, 6th edition, T.A.Brown, Wiley-Blackwell을 참고하여 작성하였습니다.

본 글의 제목은 언급된 도서의 각 챕터의 절 이름과 동일합니다.

대부분의 그림 역시 본 책에서 왔으며, 그 이외에는 따로 표시합니다.

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Chapter 6

Cloning Vectors for E. coli

 

6.3 Cloning vectors based on λ bacteriophage

Two major limitation of using λ phage DNA

① 큰 크기에 비해 넣을 수 있는 DNA 크기가 제한적 (3kb)

② 대부분의 RE에 대해 둘 이상의 recognition site를 가짐

두 한계점을 줄이기 위한 해결책

① Removal of the non-essential region: Lysogeny에 관여하는 유전자 부위(integration and excision)와 b2 region(non-essential)의 일부 혹은 모두 제거

 

 

② Natural selection: EcoRI을 소량 발현하는 E. coli에 λ phage를 도입했을 때 적은 recognition site를 가져 잘리지 않고 살아남는 phage들을 여러 단계에 거쳐 selection하여 EcoRI site를 제거

Insertion and replacement vectors

M13은 6.4kb로 두 종류의 vector 모두 이용될 때는 cos site가 연결 된 상태임을 염두에 두기

Insertion vectors

λgt10: EcoRI site를 가지는 cI gene. Up to 8kb. Gene insertion 하면 lytic cycle → Clear plaque

λZAPII: MCS를 가지는 lacZ’ gene. Up to 10kb. Gene insertion 하면 X-gal 소화 불가 → White plaque

Replacement vectors

λEMBL4: 전체 서열 중간에 양옆으로 세 쌍의 RE site를 가지는 stuffer fragment가 존재. Up to 20kb. 대칭으로 존재하며 insert DNA 크기에 따라 적당한 RE를 처리하여 최종 산물이 49kb 근처가 되도록 조정

 

 

Cloning experiments with λ insertion or replacement vectors

λ vector는 cos site를 가지므로 circular form이나 linear form으로 존재할 수 있음

Circular form λ vector는 일반 plasmid처럼 transfection에 이용될 수 있으나, 보통 transfection 효율은 매우 낮은 편

Linear form λ vector를 이용해 in vitro packaging에 의해 조립된 phage를 host cell에 감염시키는 것이 훨씬 효과적임. Phage에 의한 감염이 transfection보다 훨씬 능동적인 과정이기 때문

① 양쪽에 cos site를 가지는 linear λ vector를 준비

② Vector 내부의 서열을 인식하는 endonuclease를 처리함. Left arm, right arm이 생김

③ 삽입하고자 하는 DNA를 같은 endonuclease로 자른 후 left arm, right arm과 섞은 후 ligation. 그 결과 left arm – DNA – right arm의 구조가 반복되는 긴 DNA 분자인 catenane이 생김. Right arm과 left arm의 끝은 cos site에 의해 연결됨

④ λ phage가 적당한 크기의 left arm – DNA – right arm을 인지하고 이를 capsid 안으로 잘라 넣음

⑤ 원하는 DNA를 가지고 조립된 recombinant λ phage를 E. coli에 감염시켜 증폭시킴

 

 

Long DNA fragments can be cloned using a cosmid

Packaging에 실제로 필요한 것은 λ phage임을 이용한 방법

Cosmid: Phage DNA와 bacterial plasmid의 hybrid

pJB8은 ampR gene, ori, BamHI, cos site만을 가지는 5.4kb의 분자. Insert DNA가 삽입된 후 총 길이가 49kb 정도인 것만 조립되며 (size selection) 이 phage를 amp 첨가 배지에 균과 함께 분주하면 cosmid를 가진 colony만 선별됨 (amp selection)