[Chapter 7] Vectors for yeast and other fungi

모든 내용은 Gene Cloning and DNA Analysis, 6th edition, T.A.Brown, Wiley-Blackwell을 참고하여 작성하였습니다.

본 글의 제목은 언급된 도서의 각 챕터의 절 이름과 동일합니다.

대부분의 그림 역시 본 책에서 왔으며, 그 이외에는 따로 표시합니다.

도움이 되었다는 댓글 하나가 큰 힘이 됩니다!

Chapter 7

Cloning Vectors for Eukaryotes

 

Cloning, genomic library construction 등의 DNA work를 위해서는 E. coli를 숙주로 써도 충분하지만 약용 단백질의 대량 생산, 형질전환 등의 protein work를 위해서는 gene에 따라 적합한 숙주(단백질 발현 환경)이 필요함
진핵세포인 균류, 식물, 동물세포를 host cell로 사용하기 위해서는 또한 이에 걸맞은 vector가 요구됨

 

7.1 Vectors for yeast and other fungi

Saccharomyces cerevisiae: 균류에 속하는 출아형 효모(budding yeast). 진핵생물계의 대표적인 model organism
16쌍의 linear chromosome을 가지며, 종종 2μm plasmid를 가지기도 함
(진핵생물에서는 S, cerevisiae를 포함한 일부 yeast에게서만 plasmid가 발견됨)

Selectable markers for the 2μm plasmid

2μm

- 6kb
- Copy number: 70~200

REP1&REP2 (for replication), FLP(intramolecular recombination), D(unknown), ori

Selection은 E. coli에서처럼 항생제를 이용하듯이 항곰팡이제를 이용하지 않고 특정 아미노산 생합성 능력이 결여된 host를 이용 → Auxotrophic mutant

Mutated LEU2 gene을 가진 host(leu2- yeast)와 LEU2 gene을 가진 vector를 이용하면 transformant는 minimal medium에서도 leu를 합성하여 생존할 수 있지만 non-transformant는 생존 불가

Vectors based on the 2μm plasmid-yeast episomal plasmids

Yeast episomal plasmids(YEps): 2μm plasmid를 기반으로 만들어진 plasmid. Episomal plasmid이므로 단독으로도, episome 형태로도 존재 가능

YEp13

10.7kb

Shuttle vector: Bacteria인 E. coli와 eukaryotic cell인 yeast 둘 모두에서 발현 가능한 vector
보통 recombination, cloning은 E. coli에서, expression은 yeast에서 시행

ori (from 2μm), LEU2, ampR and tetR (from pBR322)

YEps은 LEU2를 통해 episome과 plasmid 형태를 오감

이 과정에서 mutated host LEU2와 plasmid LEU2는 homologous recombination을 일으키지만 반드시 하나는 정상, 하나는 돌연변이로 얻어지므로 screening은 여전히 가능함

Other types of yeast cloning vector

YIps: Yeast integrative plasmids. Yeast gene을 가진 bacterial plasmid. 즉, yeast ori를 가지지 않으므로 yeast 내부에서는 반드시 episome으로 존재해야 복제가 가능
YIps5는 pBR322에 URA3가 insert된 형태 (host는 URA3-를 사용해야 할 것)

YRps: Yeast replicative plasmids. Yeast chromosomal ori를 가지므로 자체 복제가 가능
Ori가 gene 바로 근처에 붙어있는 것이 특징. YRp7는 ori 근처에 TRP1을 가짐

YEps, YIps, YRps 모두 shuttle vector. 목적에 따라 셋 중에 적당한 것을 골라 사용할 수 있음

① Transformation efficiency

YEps: 10,000~100,000 transformants/ug

YIps: 1,000~10,000 / YRps: <1,000

② Copy number

YEps: 20~50 / YIps: only one / YRps: 5~100

③ Stability

YIps>YEps>YRps

Artificial chromosomes can be used to clone long pieces of DNA in yeast

Yeast artificial chromosome(YAC): Yeast chromosome 구조가 밝혀진 후에 만들어진 인공 염색체
염색체인 만큼 수 백 kb 길이의 DNA를 삽입할 수 있음
Centromere, 두 개의 telomere, 많은 수의 ori를 가짐
각각의 요소들은 yeast chromosome에서 추출, 조합됨

pYAC3

pBR322+yeast genes. 11.4kb

URA3, TRP1 genes: selection marker for auxotrophic host

CEN4 seq: 4번 염색체의 centromere 서열

TEL seq: 원형 vector일 때는 telomere가 아니지만 BamHI에 의해 linear form이 되어 yeast에 도입되면 telomere로써 기능

SUP4: Selection marker. 붉은 색소를 만드는 유전자. Target gene insertion을 위한 SnaBI recognition site를 가지고 있음

The cloning strategy with pYAC3

① Restriction with a combination of BamHI and SnaBI (left arm, middle fragment and right arm)
At this moment, left arm has TRP1 gene and right arm has URA3 gene

② Discardment of the middle fragment

③ Introduction and ligation of insert DNA with blunt end (because SnaBI makes blunt ends)

④ Protoplast transformation

⑤ Selection in the medium without trp (for right arm) and ura (for left arm)
Screening using color: white recombinant, red vector

Applications for YAC vectors

① 100kb 이상의 크기의 거대한 유전자들을 cloning 할 수 있게 됨

② 평균 600kb까지의 DNA를 수용할 수 있으므로 gene library 구축에도 굉장히 유용
Mega-YACs 등의 특별한 YACs는 1400kb까지도 수용 가능 (단 이 경우는 intramolecular recombination의 가능성이 있음)

Vectors for other yeasts and fungi

2μm plasmid는 S. serevsiae 이외의 몇 종류의 효모들에서 작동 가능

YIps와 유사한 intergrative vector들은 더 다양한 효모 내에서 작동 가능

Yeast인 Pichia pastoris, Kluveromyces lactis, 사상균인 Aspergillus nidulans, Neurospora crassa를 위한 intergrative vector도 있음