[Chapter 7] Cloning vectors for animals

모든 내용은 Gene Cloning and DNA Analysis, 6th edition, T.A.Brown, Wiley-Blackwell을 참고하여 작성하였습니다.

본 글의 제목은 언급된 도서의 각 챕터의 절 이름과 동일합니다.

대부분의 그림 역시 본 책에서 왔으며, 그 이외에는 따로 표시합니다.

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Chapter 7

Cloning Vectors for Eukaryotes

 

7.3 Cloning vectors for animals

동물 세포가 만들어내는 단백질은 E. coli나 yeast에서 제대로 발현되지 않는 경우가 있음
Gene therapy와 같은 일부 기술들은 직접 동물 세포에 유전자를 주입해야 함

→ Animal cell을 위한 cloning vector 필요

동물 세포는 plasmid를 가지지 않으므로 plasmid 복제가 불가. 즉, high copy number가 무의미함

대신 promoter의 종류를 조절해 단백질 발현량을 조절할 수 있음 (ex: CM virus 유래의 강력한 CMV promoter)

Cloning vectors for insect

초파리(Drosophila melanogaster)는 곤충 중 가장 유용하게 사용되는 모델 생명체

Gene map이 이미 한 세기 전에 밝혀졌고 homeotic selector gene들은 포유류의 그것과 유연관계가 높음

빠른 세대 교체, 많은 자손 생산, 저렴한 유지 비용도 장점

P elements as cloning vectors for Drosophila

- 2.9kb

- Transposase를 암호화하는 세 개의 gene

- 양 끝의 short inverted repeat sequence

Transposase가 만들어져 양 끝의 short inverted repeat sequence를 인식한 후 transposon을 옮김

(Transposon: 세포 내에서 여러 염색체 사이를 옮겨 다니는 10kb 미만의 유전자 조각)

P element cloning vector는 plasmid DNA로,
① inverted repeats를 가지나 transposase 서열 중간에 RE recognition site를 가진 P element와
② transposase 발현은 가능하나 inverted repeat은 없는 “wings-clipped“ element를 가짐

Plasmid가 초파리 생식 세포 내에 microinjection되면 wings clipped element가 만든 transposase에 의해 target gene이 삽입된 P element가 초파리 염색체들 중 하나로 끼어들게 되고, 초파리는 target gene을 가지는 생식 세포를 생산하게 됨

Cloning vectors based on insect viruses

Baculovirus: 재조합 단백질을 만드는 데에 유용하게 이용됨. 곤충에는 감염하나 척추동물에게는 감염하지 않음
Polyhedrin gene의 산물이 계속해서 핵 내에 축적되어 감염 말기에 inclusion body가 만들어짐

Cloning in mammals

포유동물에서의 gene cloning이 필요한 세 가지 이유

① Gene knockout: 기능이 밝혀지지 않은 유전자의 기능을 알기 위해 그 유전자를 제거(knockout)시킨 개체를 만드는 기술. 쥐를 이용한 실험에 많이 사용됨

② Pharming: 농장 동물(farm animal)로 하여금 유용한 단백질(pharmaceutical)을 만들게 하는 기술. 우유에 조혈 단백질인 erythropoietin을 많이 발현하게 하는 것이 대표적

③ Gene therapy: 인간의 질병을 치료하기 위해 질병 유전자를 대신할 정상 유전자를 직접 넣어주는 기술

Viruses as cloning vectors for mammals

Plasmid는 동물 세포 내에서 복제가 불가능하므로 virus를 이용한 cloning이 예전부터 주목받아왔으나, 현재까지도 제한된 정도로만 cloning이 이루어지고 있음

SV40: 최초로 이용된 virus. 숙주에 따라 lytic or lysogenic cycle을 가짐. λ phage처럼 size constraint 있음
보통 late gene에 target gene을 넣어 selection (early gene을 이용하기도 함)

Adenoviruses: SV40보다 큰(up to 8kb) DNA 도입 가능. Virus 자신의 DNA가 크기 때문에 다루기가 어려움

Papillomaviruses: 보다 큰 DNA 도입 가능. Bovine papillomavirus는 mouse에서 한 세포 당 100 copy 정도로 존재하면서 세포를 죽이지 않아 stable transforme cell line 구축 가능. Mouse-E. coli shuttle vector 형태도 존재

Adeno-associated virus (AAV): Adenovirus와 같은 조직에 감염, Adenovirus가 만드는 단백질을 이용해 자기 복제를 완료. 이러한 helper virus가 없을 때 AAV genome은 숙주 염색체에 끼어들어가게 되는데, 인간 세포에서는 항상 19번 염색체의 특정 부위에 삽입됨. 이 특성을 이해하면 gene therapy에 사용될 수 있을 것으로 기대됨

Retroviruses: Gene therapy에 가장 흔히 쓰임. 무작위적인 곳에 끼어들지만 굉장히 안정적으로 존재해 gene therapy 효과가 영구적임. Stable cell line을 만들 때도 자주 이용됨 → Packaging line

Gene cloning without a vector

현재는 virus를 이용한 transfection보다 효율적인 microinjection이 많이 사용됨

Bacterial plasmid나 linear DNA를 핵에 집어넣으면 이것들이 염색체 상에서 multiple copy를 이루며 끼어듦

Knockout mouse나 transgenic animal을 만드는 데 이용됨

① Mouse blastocyst에서 ES cell 꺼냄

② ES cell에 vector injection. Targeted ES cell 만듦

③ 새로운 blastocyst에 targeted ES cell 주입

④ 대리모 자궁에 착상

⑤ Chimeric mice 탄생 (normal+targeted ES cell)

⑥ Chimeric mouse와 normal mouse 교배

⑦ F2에서 gene targeted mice, normal mice 탄생