[Chapter 8] Identification of a clone from a gene library

모든 내용은 Gene Cloning and DNA Analysis, 6th edition, T.A.Brown, Wiley-Blackwell을 참고하여 작성하였습니다.

본 글의 제목은 언급된 도서의 각 챕터의 절 이름과 동일합니다.

대부분의 그림 역시 본 책에서 왔으며, 그 이외에는 따로 표시합니다.

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Chapter 8

How to Obtain a Clone of a Specific Gene

 

8.3 Identification of a clone from a gene library

Biosynthetic enzyme 이외의 유전자는 보통 이 방법을 쓰지 못함

또한, bacterial or yeast clone이 동물이나 식물의 유전자를 가진 경우에는 진핵세포 유전자가 제대로 기능하는 단백질을 원핵세포 내에서 만들기가 힘들기 때문에 marker rescue 사용 불가

Gene libraries

Genome library: a collection of clones sufficient in number to be likely to contain every single gene present in a particular organism

Total cell DNA를 분리해낸 후 이를 적당한 크기로 잘라 vector에 넣어 모든 gene에 대한 clone을 만듦

Bacteria, yeast, fungi는 그리 큰 유전체를 가지고 있지 않아 gene library를 만들기가 쉬움

아주 큰 유전체를 가진 식물이나 동물의 경우 gene library를 만들기 위해 엄청난 작업량이 요구됨

따라서 이보다는 세포 종류에 따라 다르게 발현되는 mRNA를 가지고 cDNA library를 만드는 것이 훨씬 수월하고 이용하기에도 편함

Not all genes are expressed at the same time

고등 진핵생물인 동물과 식물에서 각 세포들은 세포 종류와 시기에 따라 다른 유전자를 발현하며, 보통 전체 유전자 수에 비해 매우 적은 종류의 유전자만이 발현됨 (expressed genes and silent genes)

따라서 세포에 따라 다른 mRNA가 얻어지고, 이를 통해 어느 cell type에서 어떤 gene이 많이 발현되는지를 알 수 있음

ex) 밀(wheat)이 발아중일 때 전체 mRNA 중 30% 이상이 gliadin coding gene의 mRNA

mRNA can be cloned as complementary DNA

mRNA는 그 자체로는 vector에 삽입될 수 없으므로 동일 서열을 가진 DNA를 만드는 것이 필요

⇒ Complementary DNA (cDNA) synthesis

Reverse transcriptase를 이용해 template RNA에 상보적인 DNA 가닥을 합성할 수 있음

① mRNA를 주형으로 reverse transcriptase가 상보적인 DNA 가닥 합성. Primer로 oligo(dT)를 이용함

② RNase HI를 처리해 RNA 가닥을 부분적으로 파괴함

③ 남아있는 RNA 가닥을 primer로 삼아 DNA pol I이 반대쪽 가닥도 DNA로 바꾸어줌

④ 완성된 cDNA에 sticky end를 붙인 후 같은 end를 가지는 vector와 ligation

⑤ 이를 transformation 후 배양하여 cDNA clone을 얻어냄

단, mRNA template쪽의 DNA 가닥은 5‘ 부분이 여전히 RNA이므로 이 부분은 cDNA로 합성되지 못해 degradation될 수 있으며, 크기가 큰 진핵생물 유전자의 경우 cDNA가 완벽하게 끝까지 합성되지 않는 경우가 많음

cDNA는 세포 내에 존재하는 mRNA 집합을 대변하므로 특정한 cDNA clone이 많다는 것은 그 세포에서 해당 mRNA가 많이 발현된다는 것을 의미함