[Chapter 8] The problem of selection, Direct selection

모든 내용은 Gene Cloning and DNA Analysis, 6th edition, T.A.Brown, Wiley-Blackwell을 참고하여 작성하였습니다.

본 글의 제목은 언급된 도서의 각 챕터의 절 이름과 동일합니다.

대부분의 그림 역시 본 책에서 왔으며, 그 이외에는 따로 표시합니다.

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Chapter 8

How to Obtain a Clone of a Specific Gene

 

8.1 The problem of selection

한 생물체의 genome 내에 존재하는 특별한 유전자 하나를 얻기 위해서는 우선 genome을 잘라 cloning 해야 함

수천~수백만 개의 유전자가 존재하므로 수많은 clone 중에서 원하는 유전자만이 들어간 clone을 찾아야 함

Two basic strategies for obtaining the clone wanted

① Direct selection for the desired gene:
수많은 clone이 아닌, 오직 원하는 유전자를 가진 clone만 얻음. Plating 후 배양 과정을 통해 selection이 일어남. 주로 선호되는 방법

② Identification of the clone from a gene library:
Clone library를 이용해 원하는 유전자를 탐지해냄. Shotgun method 후 사용되는 방법. Direct selection이 불가한 경우에 이용

 

8.2 Direct selection

원하는 gene을 가지는 recombinant만 배지 위에서 살아남게 하는 것이 기본 원리

Target gene이 항생제 내성 유전자일 경우, 그 항생제에 대한 내성이 없는 균주에 genome 조각들을 cloning 한 뒤 배지에 항생제를 도말함으로써 쉽게 selection 가능

ex) Plasmid R6-5의 kanamycin resistace gene을 pBR322로 cloning 후 direct selection:
R6-5의 kanR gene은 양쪽의 EcoRI site에 의해 적당한 크기로 잘림
pBR322는 ampR, tetR을 가지나 그 내부에 EcoRI site가 없으므로 insertional inactivation은 불가하나, 삽입하려는 kanR gene의 특성을 이용해 배지에 kanamycin을 처리한 후 recombinant들을 배양하면 kanR gene을 가진 colony만 살아남음

Marker rescue

항생제 내성 유전자 이외에 생합성 관련 유전자를 이용해서도 direct seletion이 가능함

Auxotroph에 결여된 유전자를 도입해 얻어진 wild type을 selection하는 것을 marker rescue라고 함

ex) E. coli trpA- auxotroph: trpA- gene이 없으므로 Trp 포함 배지에서만 자랄 수 있음
WT E. coli의 genome을 조각내어 vector에 삽입한 뒤 E. coli trpA- auxotroph에 도입
조각난 genome 중 온전한 trpA- gene을 가진 것이 재조합되었다면 그 vector를 가진 colony만 Trp이 없는 최소배지에서 생존

생합성 유전자는 잘 보존된 편이므로 E. coli를 이용한다고 해서 E. coli 유전자만 이용할 수 있는 것이 아니라 근연종이나 멀리는 효모의 유전자까지 E. coli를 숙주로 한 marker rescue에 이용할 수 있음

The scope and limitations of marker rescue

Marker rescue는 biosynthetic enzyme을 암호화하는 대부분의 유전자에 대해, 그리고 세균뿐만 아니라 균류 등에도 적용할 수 있으나 제한점도 존재

① Target gene에 대한 mutant strain이 존재해야 함

② Wild type만 살아남고 auxotroph는 생존하지 못하는 배지가 필요함