[Chapter 8] Methods for clone identification

모든 내용은 Gene Cloning and DNA Analysis, 6th edition, T.A.Brown, Wiley-Blackwell을 참고하여 작성하였습니다.

본 글의 제목은 언급된 도서의 각 챕터의 절 이름과 동일합니다.

대부분의 그림 역시 본 책에서 왔으며, 그 이외에는 따로 표시합니다.

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Chapter 8

How to Obtain a Clone of a Specific Gene

 

8.4 Methods for clone identification

Complementary nucleic acid strands hybridize to each other

상보적인 서열의 DNA와 DNA, RNA와 RNA, DNA와 RNA 사이에 수소결합이 형성될 수 있음

→ Nucleic acid hybridization (핵산 혼성화)

두 핵산 가닥의 서열이 비슷할수록 많은 수소 결합이 생겨 안정적인 hybrid가 만들어짐

Probe가 target DNA에 붙어 hybridization을 일으키는 것을 이용해 cDNA library 등에서 원하는 유전자를 찾을 수 있음

Colony and plaque hybridization probing

in situ: ‘있는 그대로’. In situ probing method는 colony 혹은 plaque를 그대로 이용하는 probing method로, colony나 plaque를 따로 배양해서 정제하는 등의 단계를 거치지 않고 배지 위에 존재하는 상태에서 일련의 과정들을 진행함

X-ray를 이용한 in situ colony hybridization probing

① Transfer colonies to nitrocellulose or nylon membrane

② Treat bacteria with alkali to lysis cell and protease to denature protein. During this step, dsDNA is denatured into ssDNA

③ Leave the membrane at 80℃ for 2 hours, if a nitrocellulose membrane is used, or under UV with a nylon membrane to make DNA bound to the membrane through their sugar-phosphate backbones

④ Probe with labelled DNA is applied to the membrane and nucleic acid hybridization takes place in a solution of chemicals that promote hybridization

⑤ Wash to detach probes making non-specific binding

⑥ Apply X-ray film and expose the film to X-ray to take an autoradiograph

⑦ Only colonies making specific binding with probes are stained in the film

즉, 원하는 서열의 gene과 상보적인 혹은 유사한 서열을 가진 표지된 probe를 cDNA library에 뿌려 library의 어느 부분에 원하는 gene이 있는지 찾을 수 있음

Labeling with a radioactive marker

Probe는 반드시 어떤 방법으로 labeling되어 hybrid만 screening될 수 있도록 해야 함

초기에는 방사성 동위원소인 32P를 사용했으나 지금은 안전한 형광물질을 이용

dATP의 α phosphate의 P를 32P로 표지한 [α-32P]dATP를 이용해 세 가지 방법으로 labeling 할 수 있음

① Nick translation:
보통 정제된 DNA는 몇몇 부분에 nick을 가짐. DNA pol I과 [α-32P]dATP, dGTP, dCTP, dTTP를 첨가하면 nick에서부터 DNA가 합성되면서 기존의 A가 [α-32P]dAMP로 대체됨. 단, 양쪽 가닥에서 동시에 합성이 진행되므로 중간에서 가닥이 끊길 수 있음

② End filling:
5‘ overhang을 만드는 제한효소(EcoRI)를 probe 양 끝에 처리 후 Klenw fragment와 위의 nucleotide들을 넣어 끝 부분만을 labeling. EcoRI의 인식 서열이 GTTAAC 이므로 양 끝에 두 개씩의 [α-32P]dAMP가 붙으며, 다른 방법에 비해 방사성 세기가 약함

③ Labeling by random priming:
dsDNA로 합성된 probe를 열로 denaturation시켜 ssDNA로 만든 후 임의로 만들어진 hexamer oligonucleotide들을 여기에 첨가하면 Klenow fragment가 이를 primer로 삼아 가닥을 합성해나감. End filling에 비해 높은 비율로 [α-32P]dAMP를 가지며 nick translation이 가지는 끊김 문제도 가지지 않음

이렇게 만들어진 probe를 ssDNA에 뿌려 혼성화시킨 결과는 autoradiography로 확인 가능. 방사선이 X-ray-sensitive film을 까맣게 감광시키므로 혼성화된 colony의 자리만 까맣게 보이게 됨

Non-radioactive labeling

방사선은 인간에게 위험하므로 최근에는 방사성 동위원소를 이용하지 않고 형광물질을 이용함

다음의 물질들을 이용한 방법들이 사용됨

① Biotin and avidin:
Probe를 labeling 할 때 [α-32P]dATP 대신 biotin-dUTP를 이용해 nick translation / end filling / labeling by random priming을 시행. Biotin은 avidin과 높은 affinity를 보임. Avidin에는 형광 물질을 부착. ssDNA에 biotin-dUTP-labeled probe를 처리하고 형광 물질로 표지된 avidin을 이어 처리하면 혼성화된 자리만 형광을 내게 됨. Radioactive probing과 비슷한 정도의 높은 감도를 가지면서 인체에 안전하므로 많이 이용됨

② Horseradish peroxidase and luminol:
Horseradish peroxidase(HRP)는 luminol을 분해하여 빛을 내게 함(chemiluminescence). Glutaraldehyde를 이용해 HRP를 ssDNA probe에 결합시킨 뒤 이를 ssDNA에 처리하고 luminol을 넣어주면 혼성화된 자리에서 luminol이 분해되며 발광함. 이는 일반 사진 필름을 이용해서도 탐지할 수 있음

Examples of the practical use of hybridization probing

Probe와 target DNA의 hybridization을 이끌어내기 위해서는 반드시 둘 사이에 상보적인 서열이 존재해야 함

만약 target gene의 서열을 모르는 상태라면(즉 그 gene을 찾는 것이 실험의 목적인 경우) 다음의 세 가지 가능성을 통해 적당한 probe를 설계할 수 있음
- 목표 유전자가 특정 세포에서 높은 수준으로 발현되며 그 세포의 cDNA library가 구축되어 있음 → ①

목표 유전자가 만드는 단백질의 서열을 전부 혹은 일부 알고 있음 → ②

목표 유전자가 비슷한 유전자들의 모임인 gene family에 속해 있음 → ③

① Abundancy probing to analyze a cDNA library
한 세포 유형에서 가장 많이 발현되는 유전자를 찾는 방법. cDNA는 세포 내에 존재하는 mRNA 집합을 대변하므로 특정한 cDNA clone이 많다는 것은 그 세포에서 해당 mRNA가 많이 발현된다는 것을 의미함. cDNA library의 clone들로부터 각각 probe를 만들어 이를 cDNA library에 hybridization을 시킴. 가장 많은 colony와 hybridization을 하는 probe가 가장 많이 발현되는 gene의 cDNA라고 할 수 있음

② Oligonucleotide probes for genes whose translation products have been characterized
단백질의 아미노산 서열을 아는 것은 가능하므로 아미노산 서열을 통해 역으로 DNA 서열을 추정할 수 있음
하나의 아미노산을 지정하는 codon은 최소 한 개에서 최대 여섯 개까지 존재하나 codon의 세 번째 자리만이 다른 경우가 대부분. 예를 들어, Asn을 암호화하는 codon은 AAT, AAC이고 Glu의 경우는 GAA, GAG. 따라서 적절한 아미노산 서열을 선택하면 적은 수의 probe 후보들을 만들어 이용할 수 있음. 각 probe에 대해서 autoradiography 결과를 얻어내 많이 겹치는 부분이 실제 target gene을 가지는 colony일 것(그 외는 정확하지 않은 probe에 의한 non-specific signal일 가능성 있음)
많은 codon을 가지는 아미노산(ex: Leu, Arg, Ser – 6개 codon)보다는 적은 codon을 가지는 아미노산(ex: Met, Trp – 1개 codon, Gln, Asn – 2개 codon)을 선택하는 것이 핵심
Probe로 사용될 oligonucleotide는 쉽게 합성할 수 있음

③ Heterologous probing allows related genes to be identified
두 유전자가 서로 가까운 종에서 같은 기능의 단백질을 암호화할 경우 두 유전자는 유사한 서열을 가지는 경우가 많음. 공통적으로 그 유전자를 가지고 진화해왔기 때문. 이 경우 이미 알고 있는 근연종의 유전자 서열을 이용해 probe를 만들어 원하는 유전자를 찾을 수 있음
혹은 한 종 내에서도 multigene family에 속하는 한 유전자를 이용해 heterologous probing을 시행 가능

위의 방법들을 이용해 원하는 유전자를 가진 clone을 구분해내어도 아직 삽입된 기다란 cDNA의 어느 부분에 유전자가 삽입되어있는지는 모르는 상태

Southern hybridization을 이용하면 많은 restriction fragment 중 원하는 gene을 포함한 조각을 찾을 수 있음

① Hybridized clone의 DNA를 restriction enzyme으로 처리한 후 이를 전기영동시킴

② 이 상태로는 probe가 gel에 붙어버리기 때문에 Southern transfer method로 DNA를 nitrocellulose 혹은 nylon membrane으로 옮김. Wick - gel – membrane – paper tower – weight 순으로 밑에서 위로 놓고 buffer를 밑에 부어주면 buffer가 앞의 순서대로 빨려가면서 DNA도 함께 gel에서 membrane으로 이동함

③ 여기에 probe를 뿌리고 X-ray를 쬐면 여러 DNA 조각 중 원하는 유전자가 포함된 조각만 필름을 감광시킴

이렇게 gene의 위치를 알아낸 후에는 sequencing을 통해 서열을 알아내는 것이 가능

Identification methods based on detection of the translation product of the cloned gene

Probing 기술은 굉장히 많이 발달하였지만 여전히 probe를 만들 수 없는 경우가 존재

이럴 때 DNA를 탐지하는 probing 대신 산물인 protein을 탐지하는 immunological screening을 이용
Immunological screening은 ① cloning 된 유전자가 발현되고 ② 그 결과 단백질이 만들어지며 ③ 만들어진 단백질이 host cell에는 본래 존재하지 않는 상황에서 이용될 수 있음

Antibodies are required for immunological detection methods

보통 토끼를 이용해 항체(antibody, Ab)를 많이 생산함

정제된 단백질을 토끼에 주입하면 며칠 후 토끼가 그 단백질에 대한 항체를 많이 생산함

항체가 충분히 만들어진 토끼의 피는 10ml 정도만 뽑아도 immunological detection에 사용하기 충분

Using a purified antibody to detect protein in recombinant colonies

Ab를 이용한 immunological screening에는 많은 방법들이 있음

가장 대표적인 것은 direct counterpart of colony hybridization probing으로 colony 상태의 library를 그대로 이용하는 방식

다음의 분자에 Labeling을 해 detection 가능:

- Target protein을 인식하는 primary antibody

- primary antibody를 인식하는 세균 단백질인 protein A

Primary antibody를 인식하는 secondary antibody

모두 radioactive / fluorescent / chemiluminescent label 중 하나를 이용할 수 있음