[Chapter 9] The polymerase chain reaction in outline, PCR in more detail

모든 내용은 Gene Cloning and DNA Analysis, 6th edition, T.A.Brown, Wiley-Blackwell을 참고하여 작성하였습니다.

본 글의 제목은 언급된 도서의 각 챕터의 절 이름과 동일합니다.

대부분의 그림 역시 본 책에서 왔으며, 그 이외에는 따로 표시합니다.

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Chapter 9

The Polymerase Chain Reaction

 

9.1 The polymerase chain reaction in outline

Polymerase chain reaction(PCR)이 가능하게 된 것은 ① oligomer 합성 기술（즉, primer 합성 가능)의 등장과 ② Taq polymerase의 발견 덕택이라고 할 수 있음

증폭하고자 하는 양 말단 부분의 서열이 알려져 있다면 어떤 DNA라도 PCR로 증폭할 수 있음

PCR을 위한 준비물들

- DNA template

- Taq polymerase (or Pfu polymerase): 호열균인 Thermus aquaticus의 고온 활성을 지닌 DNA 중합효소

- Primers (forward and backward): DNA polymerase가 작동하기 위해서는 3’-terminus에 OH를 가진 DNA 혹은 RNA 서열이 필요하고, RNA는 나중에 분해되어버리므로 안정하며 새로운 가닥을 만들 수 있는 DNA primer를 사용

- dNTPs

- Buffer

- 반복적인 온도 조절이 가능한 장치: Denaturation, annealing, synthesis의 각 단계가 요구하는 온도를 적정 시간만큼만 유지시키고 빠르게 전환할 수 있는 장치가 필요

PCR의 단계

① 위에 언급된 모든 준비물들을 적정 비율로 한 튜브에 섞어 넣은 후 수 분 동안 denaturation 온도를 유지

② Denaturation: 94℃. 붙어있던 template DNA 두 가닥이 고온에서 수소 결합을 잃으면서 떨어짐

③ Annealing: 50-60℃. 단일 가닥이 된 template에 primer가 보다 낮은 온도에서 붙어 hybridization이 일어남

④ Synthesis: 74℃. Taq pol의 최적온도 근처이며, Taq pol이 dNTPs를 이용해서 primer 뒤에 가닥을 합성해 감

⑤ ②~④의 과정을 수십 회 반복(보통 30회 내외). 더 이상의 반응을 막기 위해 온도를 저온으로 떨어뜨림

산술적으로 계산하면 PCR을 30 cycle 시행한 후에는 원하는 DNA의 양이 약 10억 배로 증가함

하지만 무조건 cycle 수를 늘린다고 해서 좋은 것은 아님. 초기에 넣는 dNTPs 등의 농도도 고려해야 하며, Taq pol의 실수로 짧게 합성되거나 잘못 합성된 DNA들이 얻어질 확률이 증가하기 때문

PCR의 첫 번째, 두 번째 cycle에서는 증폭시키고자 하는 부분 이외의 서열을 추가로 가진 long product만 생산되나, 세 번째 cycle부터는 증폭시키고자 하는 부분의 서열만을 가진 short product가 합성, 증폭되기 시작함

 

   

9.2 PCR in more detail

Designing the oligonucleotide primers for a PCR

PCR에서 알맞은 primer를 디자인하는 것은 굉장히 중요한 단계

Polymerase가 primer를 인식해 작동하므로 primer는 단순한 template의 상보적 서열 이상의 의미를 지님

Primer는 증폭하고자 하는 전체 서열의 두 5‘ 말단 서열과 상보적이며, 3’-OH를 가져 다음 nucleotide가 붙을 수 있도록 만들어져야 함

Primer의 길이가 너무 짧으면 쉽게 적은 수의 수소결합을 만들어 non-specific binding이 일어날 가능성이 높고, 너무 길면 primer가 template와 혼성화 하는 데에 너무 많은 시간이 걸림. 보통 17-20mer 이용

Primer와는 별도로 template 역시 길이 제한이 존재. 1kb 미만의 길이를 가진 것이 적당하며 3kb를 넘어가면 제대로 가닥이 합성되지 않을 수 있음(단, 40kb 이상의 매우 긴 template 이용 시에는 다른 방법이 있음)

PCR이 잘 되었는지 확인하기 위해 PCR 산물을 DNA marker와 함께 agarose gel에서 전기영동시켜 증폭된 산물의 길이가 원하는 산물의 길이와 일치하는 지를 반드시 확인해야 함

Working out the correct temperatures to use

Denaturation – annealing – synthesis의 각 단계가 일어나는 온도를 denaturation temperature, annealing (or hybridization temperature), extension temperature이라 부름

이 중 annealing T는 반응에 따라 다를 수 있으며, template와 디자인된 primer에 따라 정해짐

- Annealing T가 높음: Mismatched hybrid는 생기기 어려우나 hybridization이 일어나기 힘듦 (specificity ↑)

- Annealing T가 낮음: Hybridization이 일어나기 쉬우나 mismatched hybrid 역시 쉽게 생김 (specificity ↓)

이 두 현상 사이에서 적절한 균형을 유지하는 primer를 만드는 것은 melting temperature의 고려를 통해 가능

Melting temperature (Tm): 완전한 primer-template hybrid의 절반이 완전히 두 가닥으로 분리되는 온도

Tm은 hybrid가 많은 수소결합을 가질수록(강하게 결합할수록) 높아지고, 적은 수소결합을 가질수록(약하게 결합할수록) 낮아짐

DNA의 AT pair는 두 개의 수소결합, GC pair는 세 개의 수소결합을 가지므로 GC pair가 많을수록 Tm 증가

다음의 식을 통해서 간단히 Tm을 계산해 볼 수 있음

Tm = (4 × [G + C]) + (2 × [A + T])°C

실제 계산은 각 염기의 수뿐만 아니라 위치도 고려해야 하지만 위의 수식으로 구한 Tm도 사용할 수 있음

Annealing temperature는 Tm보다 1-2°C 정도 낮게 설정해서 이용

또한 두 가지 primer를 동시에 이용하기 때문에 두 가지가 비슷한 Tm을 가지도록 primer를 만들어야 함