[Chapter 9] Real-time PCR enables the amount of starting material to be quantified

모든 내용은 Gene Cloning and DNA Analysis, 6th edition, T.A.Brown, Wiley-Blackwell을 참고하여 작성하였습니다.

본 글의 제목은 언급된 도서의 각 챕터의 절 이름과 동일합니다.

대부분의 그림 역시 본 책에서 왔으며, 그 이외에는 따로 표시합니다.

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Chapter 9

The Polymerase Chain Reaction

 

 

9.4 Real-time PCR enables the amount of starting material to be quantified

Carrying out a quantitative PCR experiment

PCR의 한 cycle이 지날 때마다 산물의 양은 2배로 증가하므로, 최종 산물의 양을 통해 초기 주형의 양을 역으로 추적할 수 있음 → Quantitative PCR (qPCR)

Real-time PCR은 qPCR의 한 종류로, cycle을 거치며 증가하는 산물의 양을 확인할 수 있음

PCR product의 양을 확인하기 위해서는 다음과 같은 방법들을 사용할 수 있음

① dsDNA의 사이에 끼어드는 형광물질을 이용해 합성된 dsDNA의 양을 추정. 형광물질로는 SYBR green을 많이 이용. 비특이적 결합으로 인한 primer dimer 혹은 일시적인 primer-template 때문에 실제보다 양이 많은 것처럼 보일 수 있음

② Reporter probe를 이용. Reporter probe는 DNA template와 결합할 수 있으며 한 쪽에는 fluorescent label, 반대쪽에는 quenching compound를 가짐. Probe의 양끝 서열은 서로 상보적이기 때문에 hairpin 구조를 만들기 쉬우며, 이 구조에서 quenching compound가 fluorescent label을 비활성화시킴. Hairpin이 풀리고 probe가 DNA와 hybridization을 하게 되면 quenching compound와 떨어진 label이 발광. ①의 방법보다 훨씬 정확성이 높음

초기에 template을 많이 가질수록 최종 형광의 양이 많고, 형광이 더 빨리 감지됨

Real-time PCR can also quantify RNA

Real-time PCR은 DNA 뿐만 아니라 RNA을 이용해서도 시행될 수 있음

Reverse transcriptase PCR(RT-PCR)은 RNA를 우선 sscDNA로 만든 다음 이것에 대해 PCR을 시행하는 방법

어떤 RNA가 활발히 합성되느냐를 보고 질병 여부를 진단 가능 (ex: 암, 바이러스 감염)

일부 polymerase는 RNA와 DNA를 모두 주형으로 해서 반대 가닥을 합성할 수 있어 일반적인 PCR과 RT-PCR 모두에 이용될 수 있음