[Chapter 10] The methodology for DNA sequencing

모든 내용은 Gene Cloning and DNA Analysis, 6th edition, T.A.Brown, Wiley-Blackwell을 참고하여 작성하였습니다.

본 글의 제목은 언급된 도서의 각 챕터의 절 이름과 동일합니다.

대부분의 그림 역시 본 책에서 왔으며, 그 이외에는 따로 표시합니다.

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Chapter 10

Sequencing Genes and Genomes

 

10.1 The methodology for DNA sequencing

Chain termination DNA sequencing

Fred Sanger와 동료들이 발명한 최초의 sequencing 방법. Sanger method라고도 함

Gel 상에서 ssDNA가 길이에 따라 분리되며, nucleotide 하나의 차이로도 분별 가능한 것에서 착안됨

10-1500nt 길이의 서열을 분석할 수 있음

Chain termination sequencing in outline

- 서열을 알고자 하는 ssDNA

- DNA polymerase

- Primer

- dNTP

- one of four ddNTP labelled with fluorescent marker

     

주어진 DNA에 대해 PCR을 시행하되, dNTP와 함께 낮은 농도의 ddNTP를 넣어줌

ddNTP는 dideoxynucleotide로, 3‘-OH가 3’-H로 치환되어 있어 새로운 nucleotide가 붙을 수 없는 구조

DNA pol은 dNTP와 ddNTP를 구분하지 못하므로 ddNTP가 붙어 신장이 되지 못하는 가닥들이 여러 길이로 만들어짐

네 종류의 ddNTP는 서로 다른 형광 마커를 가지며, 각각에 대해 PCR을 독립적으로 시행

이 결과를 gel에 loading하면 중간에 합성이 중단된 여러 길이의 가닥들이 길이별로 나열되며, 나열된 가닥들이 내는 형광을 순서대로 읽으면 서열을 알아낼 수 있음 (가장 짧은 가닥부터 읽음)

감광된 필름의 결과를 눈으로 읽거나 형광 검출기를 이용해 자동으로 서열을 알아낼 수도 있음

Not all DNA polymerases can be used for sequencing

Chain termination sequencing의 핵심은 ①만들어진 가닥들이 가닥 끝에만 단 하나의 ddNTP를 가지는 것과 ② 서로 다른 길이의 가닥들이 template DNA의 첫 번째 nucleotide부터 합성되는 것

즉, 하나의 길이에 하나의 형광(하나의 ddNTP)만이 발생하는 것이 전제조건

만약 5‘→3’ exonuclease activity를 가지는 DNA pol을 사용한다면 가닥들의 앞부분이 잘려나가 가닥 길이에 따라 순서대로 서열을 읽을 수 없게 됨

3‘→5’ exonuclease activity를 가지는 DNA pol은 끝의 ddNTP를 잘라버려 형광이 발생하지 않을 수 있음

따라서 exonuclease activity를 가지지 않는 효소를 이용해야 함

① Klenow fragment: E. coli의 DNA pol I에서 5‘→3’ exonuclease activity를 없앤 것. 상당히 짧은 길이(up to 250bp)의 가닥만 합성할 수 있음 → low processivity

② Sequenase: T7 phage의 DNA pol을 변형한 것. 750bp까지의 가닥을 합성할 수 있음 → high processivity

Chain termination sequencing requires a single-stranded DNA template

Chain termination sequencing을 위해서는 ssDNA가 주형으로 요구되며(dsDNA의 두 가닥은 상보적이긴 하지만 서열이 완전히 다르다는 것을 기억하기) ssDNA을 얻기 위해 다음 방법들을 이용할 수 있음

① M13 vector: ssDNA를 얻기 위해 가장 흔히 이용 가능. Cloning 할 DNA의 길이가 3kb를 넘어가면 deletion이나 rearrangement가 일어날 확률이 높아 짧은 서열에 대해서만 제한적으로 쓰임

② Plasmid: Double strand이지만 alkali 처리 혹은 boiling을 통해 단일 가닥으로 얻어질 수 있음. 단, plasmid가 극히 고순도로 얻어져야만 가능 (bacterial DNA나 RNA가 섞여 들어가면 안 됨)

③ Phagemid: M13의 ori를 가진 plasmid로 ssDNA 혹은 dsDNA 상태로 얻어질 수 있음. M13이 가지는 불안정성이 없어 10kb까지의 DNA를 도입할 수 있음

ssDNA를 얻은 후 thermal cycle sequencing을 이용해 template를 증폭시킴

Thermal cycle sequencing은 PCR과 비슷하나 하나의 primer와 네 종류의 ddNTP를 이용한다는 점이 다름

Primer를 하나만 이용하기 때문에 PCR처럼 기하급수적인 증폭이 아닌 산술급수적인 증폭이 일어나며, 각 cycle마다 서로 다른 길이의 가닥이 얻어질 수 있음

이후 얻어진 결과를 가지고 sequence analysing이 가능함

The primer determines the region of the template DNA that will be sequenced

① Universal primer: Vector DNA의 일부분에 상보적. 이 뒤쪽으로 삽입된 DNA가 증폭됨. 삽입된 DNA가 길 경우 일반적인 PCR처럼 forward, reverse primer를 모두 이용하여 앞과 뒤에서부터 서열을 구할 수 있음

② Internal primer: DNA insert 내부의 서열에 대해 상보적. Universal primer와 함께 쓰이며, reverse primer가 뒤쪽에서부터 서열을 읽어주는 것과 반대로 forward primer와 같은 방향으로 가닥을 합성해나감. Universal primer와 internal primer에 의해 읽혀진 서열을 겹쳐서 전체 서열을 알아낼 수 있음

Pyrosequencing

Chain termination sequencing보다 짧은 150bp 이하의 길이의 서열에만 적용할 수 있지만, 거의 모든 단계가 자동으로 일어난다는 것이 매우 큰 특징. 한 번에 엄청난 수의 서열을 한 번에 분석할 수 있어 single run에 1000Mb의 서열을 분석하는 것도 가능

Pyrosequencing involves detection of pulses of chemiluminescence

- ssDNA

- Primer

- dNTP

- DNA polymerase

- ATP sulfurylase

- Luciferase

- Apyrase

① 네 종류의 dNTP는 한 번의 반응에 한 종류만 이용되도록 번갈아 유입됨(한 종류의 dNTP가 유입된 상황을 아래에서 편의상 한 cycle이라 표현함). Template로 ssDNA 이용

② 이번에 합성되어야 할 것이 네 염기 중 G일 경우, DNA pol이 dGTP를 가닥에 붙이면서 PPi, 즉 pyrophosphate를 방출함

③ Pyrophosphate는 ATP sulfurylase에 의해 ATP로 전환됨

④ 전환된 ATP는 luciferase가 기질을 사용해 빛을 내는 데에 이용됨

⑤ 발생된 빛은 검출기에 읽히고, dGTP가 유입된 cycle이므로 G가 하나 합성되었다고 인식됨

⑥ G가 연달아 두 개 있을 경우 빛이 두 배의 세기로 발생하므로 검출기는 G가 두 개 합성됨을 인식함

⑦ G가 합성되어야 하는데 dATP, dCTP, cTTP가 유입된 cycle일 경우 아무 것도 합성되지 않으므로 빛이 발생하지 않음

⑧ 한 cycle이 끝나고 남은 염기들은 다음 cycle이 시작되기 전에 apyrase에 의해 빠르게 제거됨

⑨ 위의 과정을 반복. 가닥이 합성됨과 동시에 서열이 읽힘

참고 동영상>> https://www.youtube.com/watch?v=nFfgWGFe0aA

Chain termination sequencing에서는 ddNTP에 따라 다른 종류의 형광이 이용되었지만 pyrosequencing에서는 한 종류만의 빛만이 발생하며 빛이 발생하는 타이밍에 따라 어떤 염기가 붙는지를 알 수 있음

Massively parallel pyrosequencing

Pyrosequencing은 대량의 DNA에 대해 빠르고 정확한 서열 분석을 빠르게 해 낼 수 있으므로 genomic DNA의 서열 분석에 많이 이용됨

한 번에 긴 서열의 분석은 어려우므로 DNA를 300-500bp 길이로 자른 뒤 양쪽에 adaptor를 하나씩 붙임

한 adaptor에는 biotin을 붙여 DNA를 streptavidin으로 코팅된 metallic bead에 붙게 함

(Biotin은 avidin과 매우 특이적인 결합을 함)

다른 adaptor는 primer annealing site를 제공. 모든 DNA fragment가 동일한 primer로 증폭될 수 있음

하나의 bead에는 하나의 DNA만 붙으며, 이 bead는 oil emulsion 속의 물방울 속에 들어가 PCR을 진행함

즉 물방울 하나에서 한 DNA의 PCR이 일어나며, 서로 다른 DNA fragment들의 PCR product가 섞이지 않음

PCR 종료 후 각각의 물방울은 옮겨져 pyrosequencing을 거치게 됨