[Chapter 9] After the PCR: studying PCR products

모든 내용은 Gene Cloning and DNA Analysis, 6th edition, T.A.Brown, Wiley-Blackwell을 참고하여 작성하였습니다.

본 글의 제목은 언급된 도서의 각 챕터의 절 이름과 동일합니다.

대부분의 그림 역시 본 책에서 왔으며, 그 이외에는 따로 표시합니다.

도움이 되었다는 댓글 하나가 큰 힘이 됩니다!

Chapter 9

The Polymerase Chain Reaction

 

 

9.3 After the PCR: studying PCR products

PCR은 기본적으로 특정 DNA 서열을 증폭하는 것이지만, 이는 매우 다양한 실험에 응용될 수 있음

PCR product를 이용한 gel electrophoresis, cloning, sequencing은 굉장히 많이 사용되는 실험 기법들임

Gel electrophoresis of PCR products

Gel eletrophoresis를 통해 ① PCR product가 성공적으로 증폭되었는지(DNA marker와의 비교를 통한 band 위치 확인) ② PCR product가 대략적으로 얼마나 생산되었는지(band 굵기 확인) ③ 잘못된 주형이 증폭되거나 시료가 오염되는 등 다른 문제가 발생하지는 않았는지(다른 band 유무 확인)를 확인할 수 있음

이처럼 PCR이 잘 되었는지를 확인하는 용도 이외에도 PCR과 gel electrophoresis를 이용한 다양한 실험이 가능

Restriction fragment length polymorphism (RFLP) analysis: Genome map 구축과 유전병 검사에 이용

DNA profiling: Insertion of deletion mutation의 유무를 찾아냄. 법의학에서 이용

Combinatorial screening: Genomic or cDNA library에서 원하는 유전자에 대한 screening을 진행

Cloning PCR products

PCR로 증폭된 산물은 vector에 삽입된 후 cloning에 이용될 수 있음

Taq pol은 종종 blunt end를 만드는 대신 PCR 산물의 3‘ 말단에 nucleotide 하나를 더 붙이는 경우가 많으며, 대부분의 경우 A를 추가로 붙임. 이를 고려한 cloning 방법에는 아래의 세 가지가 있음

① T를 3’ 말단에 하나씩만 가진 vector를 만들면(T-tailed vector) 두 DNA 분자가 짧은 overhang에서 결합하게 되고, ligation을 통해 말끔히 이어질 수 있음. 가장 많이 쓰이는 방법

② PCR product의 끝을 잘라 blunt end로 만든 후 ligation. Exonuclease가 과하게 활성을 띠면 안쪽 서열까지 소화될 우려가 있으므로 잘 쓰이지 않음

③ Restriction site를 포함하는 primer를 디자인하면 PCR product를 RE 처리 후 바로 원하는 vector에 삽입할 수 있음. Primer는 restriction site를 포함하므로 첫 번째와 두 번째 PCR 주기에서는 primer가 template에 일부 서열로만 결합한 상태이며, 세 번째 주기부터는 restiction site도 상보적인 서열을 가지게 되어 최종적으로는 template의 양 말단에 restriction site를 포함한 모양의 PCR product가 얻어짐

Problems with the error rate of Taq polymerase

대부분의 DNA polymerase는 DNA 합성을 잘못 하면 이를 교정할 수 있는 proofreading 기능을 가짐. 이는 이들 DNA pol이 3‘ to 5’ exonuclease activity를 가지기 때문에 가능

Taq pol의 경우 proofreading activity가 없어 종종 잘못된 서열을 합성함(9000 nucloetides 중 하나 꼴). 비록 error rate가 낮더라도 PCR의 특성상 이 error 역시 증폭될 수 있음(30 cycle 시행 시 300nt 중 하나 꼴)

① 잘못 합성된 산물을 sequencing에 이용할 경우, 모든 산물이 제각각 다른 위치에 오류를 가지므로 전체적으로는 올바른 서열을 가진 가닥이 대부분이기 때문에 sequencing에는 별다른 문제가 없음

② 잘못 합성된 산물을 cloning에 이용할 경우, 제각기 다른 오류를 가진 수많은 colony들이 생성됨(한 colony 내의 세포들은 동일한 오류를 가짐). 이러한 특성 때문에 PCR product는 cloning보다는 다른 용도에 이용하는 것이 훨씬 좋고, cloning에 이용된다면 cloning 이후에 sequencing으로 올바르게 증폭된 서열을 가진 colony를 분별해내는 과정이 필요함